רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי
Summary
This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.
Abstract
מיקרוסקופיה המולקולה בודדת מתגלה כגישה רבת עוצמה כדי לנתח את ההתנהגות של מולקולות איתות, בפרט בנוגע לאלו היבט (למשל., קינטיקה, דו קיומן של מדינות שונות ובאוכלוסיות, אינטראקציות חולפות), אשר מוסתרות בדרך כלל במדידות הרכב, כגון אלו שהושגו עם שיטות ביוכימיות או במיקרוסקופ רגילה. לפיכך, אירועים דינמיים, כגון אינטראקציות רצפטור לרצפטור, יכולים להיות מיושמים בזמן אמת בתא חי עם רזולוציה spatiotemporal גבוהה. פרוטוקול זה מתאר שיטה המבוססת על תיוג עם fluorophores האורגני קטן ובהיר וקרינת השתקפות הפנימית מוחלטת מיקרוסקופיה (TIRF) ישירות לדמיין קולטנים בודדים על פני השטח של תאי חיים. גישה זו מאפשרת למקם במדויק קולטנים, למדוד את הגודל של מתחמי הקולטן, וללכוד אירועים דינמיים כגון אינטראקציות קולט קולט חולפות. הפרוטוקול מספק תיאור מפורט של איך perform ניסוי מולקולה בודדת, ובכלל זה הכנת מדגם, רכישת תמונה וניתוח תמונה. כדוגמא, היישום של שיטה זו כדי לנתח שני G-חלבון בשילוב קולטנים, כלומר., Β רצפטור סוג חומצת B-2 adrenergic וγ-aminobutyric (GABA-B), הוא דיווח. הפרוטוקול יכול להיות מותאם לחלבונים אחרים קרום ודגמים סלולריים שונים, שיטות transfection ואסטרטגיות תיוג.
Introduction
קולטנים הממוקמים על פני התא לחוש את הסביבה תאית ולהגיב למגוון של גירויים, כמו הניחוח, יונים, נוירוטרנסמיטורים והורמונים קטנים חלבון גדולים. טבע הנוזל של קרומים תאיים מאפשר תנועות של קולטנים וחלבונים קרום אחרים. זה חיוני להיווצרות של קומפלקסי חלבונים ואת המופע של אינטראקציות בין חלבונים חולפים, כגון אלו המשמשים על ידי קולטנים להרכיב ליחידות פונקציונליות וtransduce אותות לתוך התא הפנימי. לדוגמא, ה-G–חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), המהווה את המשפחה הגדולה ביותר של קולטני 1 על פני קרום התא, הוצעו להקים di-/oligomers, המופיע להיות מעורבים בוויסות מכויל של התמרה אות ו אולי יש השלכות פיסיולוגיות ותרופתיות חשובות 2-5.
יש מיקרוסקופיה המולקולה בודדת את הפוטנציאל הגדול של ישירות חזותי גבוה spatiotempרזולוציה אוראלית ההתנהגות הדינמית של קולטנים בודדים הממוקמים על פני השטח של תאי חיים, ובכלל זה הקשר שלהם ליצירת הדימרים וקומפלקסים מולקולריים מסדר גבוה יותר 6-10. זה מציע מספר יתרונות בהשוואה לשיטות ביוכימיות ומיקרוסקופיה רגילות, אשר בדרך כלל לדווח על ההתנהגות הממוצעת של אלפים או מיליון של מולקולות.
תיוג חלבון עם fluorophore מספיק בהיר וphotostable חיוני למיקרוסקופיה מולקולה בודדת. פרוטוקול זה מנצל את תג SNAP הציג לאחרונה 11 לצרף קוולנטית fluorophores האורגני קטן ובהיר לקולטנים על פני קרום תא. SNAP הוא 20 תג חלבון KD נגזר מalkyltransferase אדם תיקון DNA O אנזים 6-alkylguanine-DNA, אשר יכולה להיות מתויג באופן בלתי הפיך עם benzylguanine fluorophore מצומדות נגזרים (fluorophore-BG). CLIP, תג מהונדס נוסף הנגזר מSNAP, יכול להיות מתויג במקום עם fluorophore-cנגזרי benzylcytosine onjugated 12.
הפרוטוקול שפורסם בכתב היד הזה מסביר כיצד transfect והתווית SNAP-מתויג 11 קולטנים עם fluorophores האורגני הקטן ולהשתמש בקרינת השתקפות הפנימית מוחלטת מיקרוסקופיה (TIRF) כדי להמחיש קולטנים בודדים או מתחמי קולטן על פני השטח של תאי חיים 10. התוצאות שדווחו בפרוטוקול> 90% יעילות תיוג של חלבון על פני קרום תא 10 מתויג-SNAP extracellularly. מידע נוסף על אופן השימוש בנתוני מולקולה בודדת כדי לנתח את הגודל וניידות של מתחמי הקולטן, כמו גם כדי ללכוד אינטראקציות קולט קולט חולפות, מסופק. זרימת עבודה סכמטי של הפרוטוקול כולו היא נתון באיור 1. כדוגמא, transfection של סינית שחלות תאים (CHO) עם-G-חלבון בשילוב קולטנים מתויג-SNAP (GPCRs) ואחריו על ידי תיוג עם נגזר fluorophore-BG כמו גם היישום שלה לquantify וdi-/oligomerization קולט הצג מתוארים. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב לחלבונים על פני קרום תא אחרים ותגי ניאון (למשל., CLIP), כמו גם לשיטות transfection וסימון אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר מאפשר ניתוח של סידור המרחבי, הניידות וגודל של מתחמי קולטן על פני קרום התא ברמת מולקולה בודדת. בהשוואה לשימוש בחלבוני ניאון, תיוג עם fluorophores האורגני קטן, שהם בהירים וphotostable יותר, יש יתרון בכך שהתיר להדמיה ממושכת של חלקיקי קולטן אחד. מאז רמות ביטוי נמוכו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The development of this protocol was supported by grants from the European Research Council (Advanced Grant TOPAS to M.J.L.) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 to D.C. and SFB487 to M.J.L.). T.S. was supported by the Alexander von Humboldt Foundation.
Materials
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | CAUTION: strong base and highly corrosive reagent |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Glass coverslip | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness |
| 0.2 mm sterile filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO cells | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovary cell line |
| 6-well cell culture plare | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Phenol-red free medium |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | |
| Penicillin – streptomycin | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| Fluorophore-conjugated benzylguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| Imaging buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Imaging chamber | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, for microscopy |
| TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
| TIRF objective | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
| EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| Temperature controller | Pecon | Tempcontrol 37-2 digital | |
| ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab software | The MathWorks, USA |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Angers, S., Salahpour, A., Bouvier, M. Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 42, 409-435 (2002).
- Ferré, S., et al. Building a new conceptual framework for receptor heteromers. Nat Chem Biol. 5, 131-134 (2009).
- Milligan, G. G. protein-coupled receptor hetero-dimerization: contribution to pharmacology and function. Br J Pharmacol. 158, 5-14 (2009).
- Lohse, M. J. Dimerization in GPCR mobility and signaling. Curr Opin Pharmacol. 10, 53-58 (2010).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. Subunit counting in membrane-bound proteins. Nat Methods. 4, 319-321 (2007).
- Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59, 359-374 (2008).
- Hern, J. A., et al. Formation and dissociation of M1 muscarinic receptor dimers seen by total internal reflection fluorescence imaging of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 2693-2698 (2010).
- Kasai, R. S., et al. Full characterization of GPCR monomer-dimer dynamic equilibrium by single molecule imaging. J Cell Biol. 192, 463-480 (2011).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 743-748 (2013).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chem Biol. 15, 128-136 (2008).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26, 373-399 (1997).
