Høyoppløselig Spatiotemporal Analyse av Receptor Dynamics av Single-molekyl fluorescens mikroskopi
Summary
This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.
Abstract
Single-molekyl mikrosfremstår som en kraftfull tilnærming til å analysere atferden til signalmolekyler, særlig når det gjelder de aspekt (f.eks., Kinetikk, sameksistens mellom ulike stater og bestander, forbigående interaksjoner), som vanligvis er skjult i ensemble målinger, som for eksempel de som oppnås med vanlige biokjemiske eller mikroskopi metoder. Således, dynamisk hendelser, slik som reseptor-reseptor-interaksjoner, kan bli etterfulgt i sann tid i en levende celle med høy oppløsning tid og rom. Denne protokollen beskriver en metode basert på merking med små lyse og organiske fluoroforer og total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi for å visualisere direkte enkelt-reseptorer på overflaten av levende celler. Denne tilnærmingen gjør det mulig å nøyaktig lokalisere reseptorer, måle størrelsen på reseptor komplekser, og fange dynamiske hendelser som forbigående reseptor-reseptor interaksjoner. Protokollen gir en detaljert beskrivelse av hvordan du perform en single-molekyl eksperiment, blant annet eksempler på bildeanalyse forberedelse, image oppkjøpet og. Som et eksempel på anvendelsen av denne metoden analysere to G-protein-koblede reseptorer, f.eks., Β 2-adrenerge og γ-aminosmørsyre type B (GABA B) reseptoren, er rapportert. Protokollen kan tilpasses til andre membranproteiner og forskjellige cellemodeller, transfeksjonsmetoder og merking strategier.
Introduction
Reseptorer lokalisert på celleoverflaten avføle det ekstracellulære miljø og svare på en rekke stimuli, som for eksempel luktstoffer, ioner, små nevrotransmittere og store proteinhormoner. Væsken natur cellulære membraner tillater bevegelser av reseptorer og andre membran proteiner. Dette er viktig for dannelsen av proteinkompleksene og forekomst av transiente protein-protein interaksjoner, slik som de som brukes av reseptorer for å montere inn i funksjonelle enheter, og transduce-signaler inn i cellens indre. For eksempel, G-protein-koblede reseptorer (GPCR), som utgjør den største familie av celleoverflatereseptorer 1, er blitt foreslått å danne di-/oligomers, som synes å være involvert i finjustert regulering av signaltransduksjon og kan ha viktige fysiologiske og farmakologiske konsekvenser 2-5.
Single-molekyl mikroskopi har det store potensialet for direkte visualisere med høy spatiotemporal oppløsning den dynamiske oppførsel av individuelle reseptorer lokalisert på overflaten av levende celler, inkludert deres forening til å danne dimerer og høyere ordens molekylære komplekser 6-10. Dette gir flere fordeler sammenlignet med vanlige biokjemiske og mikroskopi metoder, som vanligvis rapporterer den gjennomsnittlige oppførsel av tusenvis eller millioner av molekyler.
Proteinmerking med tilstrekkelig lys og photo fluoroforen er viktig for enkelt-molekyl mikroskopi. Denne protokollen tar fordel av den nylig innførte SNAP tag 11 til kovalent feste små og lyse organiske fluoroforene til celle-overflate reseptorer. SNAP er et 20 kD protein-koden avledet fra humant DNA reparasjonsenzym 6-alkylguanine-DNA alkyltransferase, som kan være irreversibelt merket med fluorofor-konjugert benzylguanine (fluorofor-BG)-derivater. CLIP, en ytterligere konstruert signal avledet fra SNAP, kan i stedet merket med fluorofor-conjugated benzylcytosine derivater 12.
Protokollen rapportert i dette manuskriptet forklarer hvordan du transfektere og etiketten SNAP-merket 11 reseptorer med små organiske fluorophores og bruke total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi for å visualisere enkelt reseptorer eller reseptor komplekser på overflaten av levende celler 10. De rapporterte protokollresultatene i> 90% merking effektiviteten av et ekstracellulært SNAP-merket celle-overflateprotein 10. Ytterligere informasjon om hvordan man skal benytte en-molekyl data for å analysere størrelsen og mobiliteten av reseptor-komplekser, så vel som for å fange opp kortvarige reseptor-reseptor-vekselvirkninger, er gitt. En skjematisk arbeidsflyt av hele protokoll er gitt i figur 1.. Som et eksempel, transfeksjon av kinesisk hamsterovarie (CHO) celler med SNAP-merket G-protein-koblede reseptorer (GPCR), etterfulgt av merking med en fluorofor-BG-derivat som vel som sin søknad til quantify og monitor reseptor di-/oligomerization er beskrevet. Denne protokollen kan bli utvidet til andre celle-overflateproteiner og fluorescerende tags (f.eks., CLIP), samt til andre transfeksjonsteknologier og merking metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne protokoll tillater analyse av den romlige arrangement, mobilitet og størrelsen av celle-overflate-reseptor-kompleksene ved enkelt-molekyl nivå. Sammenlignet med bruk av fluorescerende proteiner, merking med små organiske fluoroforer, som er lysere og mer photo, har fordelen av å tillate utvidet visualisering av enkelt reseptor partikler. Siden ekstremt lave nivåer blir oppnådd (<0,45 reseptor partikler / mikrometer 2), egenskapene til reseptorene og andre membran-proteiner kan bli analy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The development of this protocol was supported by grants from the European Research Council (Advanced Grant TOPAS to M.J.L.) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 to D.C. and SFB487 to M.J.L.). T.S. was supported by the Alexander von Humboldt Foundation.
Materials
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | CAUTION: strong base and highly corrosive reagent |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Glass coverslip | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness |
| 0.2 mm sterile filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO cells | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovary cell line |
| 6-well cell culture plare | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Phenol-red free medium |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | |
| Penicillin – streptomycin | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| Fluorophore-conjugated benzylguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| Imaging buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Imaging chamber | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, for microscopy |
| TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
| TIRF objective | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
| EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| Temperature controller | Pecon | Tempcontrol 37-2 digital | |
| ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab software | The MathWorks, USA |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Angers, S., Salahpour, A., Bouvier, M. Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 42, 409-435 (2002).
- Ferré, S., et al. Building a new conceptual framework for receptor heteromers. Nat Chem Biol. 5, 131-134 (2009).
- Milligan, G. G. protein-coupled receptor hetero-dimerization: contribution to pharmacology and function. Br J Pharmacol. 158, 5-14 (2009).
- Lohse, M. J. Dimerization in GPCR mobility and signaling. Curr Opin Pharmacol. 10, 53-58 (2010).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. Subunit counting in membrane-bound proteins. Nat Methods. 4, 319-321 (2007).
- Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59, 359-374 (2008).
- Hern, J. A., et al. Formation and dissociation of M1 muscarinic receptor dimers seen by total internal reflection fluorescence imaging of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 2693-2698 (2010).
- Kasai, R. S., et al. Full characterization of GPCR monomer-dimer dynamic equilibrium by single molecule imaging. J Cell Biol. 192, 463-480 (2011).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 743-748 (2013).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chem Biol. 15, 128-136 (2008).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26, 373-399 (1997).
