3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית
Summary
In this video protocol we track – at high speed and in three dimensions – fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.
Abstract
מטרת פרוטוקול וידאו זה היא לדון כיצד לבצע ולנתח ניסוי מסלולית ניאון תלת ממדי מעקב אחר חלקיקים באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים שונה 1. בניגוד לגישות קונבנציונליות (סריקה סריקה או שדה רחב המבוסס על ערימה של מסגרות), המעקב מסלולית 3D מאפשר למקם ופעל עם מרחבית גבוהה (10 דיוק ננומטר) ורזולוציה של זמן (תגובת תדר 50 הרץ) עקירת 3D של חלקיקי ניאון נעו על אורך קשקשים של מאות מיקרונים 2. השיטה מבוססת על אלגוריתם משוב ששולט בחומרה של מיקרוסקופ סריקת לייזר שני פוטונים על מנת לבצע מסלול מעגלי מסביב לאובייקט להיות במעקב: מנגנון המשוב ישמור את אובייקט הניאון במרכז על ידי שליטה על התזוזה של קרן הסריקה 3-5. כדי להדגים את היתרונות של טכניקה זו, אנחנו אחרי אברון זז מהר, הליזוזום, בתוך אלתא iving 6,7. תאים היו מצופים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, ומוכתם באמצעות צבע מסחרי הליזוזום. אנו דנים בקצרה את תצורת החומרה ובפירוט רב יותר את תוכנת שליטה, לבצע ניסוי מעקב מסלולית 3D בתוך תאי חיים. אנו דנים בפירוט הפרמטרים הנדרשים על מנת לשלוט במיקרוסקופ הסריקה ולאפשר התנועה של האלומה במסלול סגור סביב החלקיקים. אנו מסיקים על ידי המדגימים כיצד שיטה זו ניתן להשתמש ביעילות כדי לעקוב אחר התנועה מהירה של הליזוזום שכותרתו לאורך microtubules ב3D בתוך תא חי. יזוזומים יכולים לנוע במהירויות בטווח של 0.4-0.5 מיקרומטר / sec, בדרך כלל מוצגות תנועה בבימויו לאורך רשת microtubule 8.
Introduction
מספר גדול של גישות פותחו עד כה כדי לעקוב אחר חלקיקי ניאון בשלושה ממדים באמצעות מיקרוסקופ. רוב הגישות מסתמכות על השימוש במצלמות מהירות, מתאימות באופן אידיאלי למעקב בשני ממדים, בשילוב בדרך כלל עם שינויים מותאמים אישית של אופטיקה הפליטה של מיקרוסקופ כדי להשיג מעקב בכיוון הצירי. מיקרוסקופי סריקת לייזר (או confocal או שני פוטונים) כמקובל יכול לעקוב אחר חלקיקי ניאון על ידי ביצוע רצף של z-ערימות זמן, למרות שתהליך זה הוא בדרך כלל זמן רב, ומניב רזולוציה זמן סבירה (10 Hz) רק אם במעקב החלקיקים הוא המשיך במרכז אזור הדמיה סריקה קטן על ידי מנגנון משוב פעיל 2.
הרעיון של נעילה לחלקיקים הוא הבסיס של שיטת המעקב מסלולית. במקום סריקה לסרוק מסלול מעגלי מתבצע סביב חלקיקי הניאון. עוצמת הקרינה לאורךהמסלול בדיוק מתאים את עמדת חלקיקי 4.
העמדה המקומית של החלקיקים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להניע סורקי מיקרוסקופ ומחדש מרכז המסלול בעמדת החלקיקים. סורקי גלונומטר של המיקרוסקופ מונעים על ידי מתח אנלוגי. רכיב AC של מתח זה מאפשר לבצע מסלול עם קרן הלייזר הממוקדת, כלומר סינוס וקוסינוס גל פנה למראות X וסריקת Y יאפשר ביצוע מסלול מעגלי. DC לקזז של האות מקל לשנות את מיקומו של מרכז המסלול. ברגע שתקופת מסלול נקבעה ואת צורת הגל לאות AC מוגדרת, מערכת המשוב צריכה לעדכן את רכיב DC רק של האות.
תוכנה מסוגלת לקרוא את אות הניאון שנאסף מהגלאים נדרשה לשלוט הסורקים וגלאים, כדי לחשב את המיקום של החלקיק ולעדכן את DC אתנקבע. למשוב מוצלח הדמיה בחירה זהירה של הפרמטרים המסלול (גודל ועיתוי) דרוש ופרמטרים אלה צריכים להיות מותאמים המבוססים על המאפיינים של חלקיקי הניאון שיש צורך לעקוב אחר.
היסודות הפיזיים ומתמטיים של הטכניקה תוארו ב4,5 העבר עבור שני יישומי 2D and 3D. בפרוטוקול זה אנו מתארים בקצרה את רכיבי החומרה המרכזיים של ההתקנה, ובפירוט רב יותר נדרשים הבחירה של הפרמטרים והכנת המדגם לניסוי טיפוסי מאפשר לנו הבא לעקירתם של הליזוזום ברזולוציה גבוהה זמנית בתוך תא חי.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות ההתקדמות העצומה בטכניקות הקרינה מיקרוסקופיה וinstrumentations בשנים האחרונות, להשגת מסלולים של חלקיקי ניאון בשלושה ממדים עם רזולוציה גבוהה זמנית נשאר אתגר בתחום. אם רזולוציה גבוהה זמנית הושגה חלקיקי מעקב בשני ממדים, הרחבה לכיוון הצירי בדרך כלל מביאה לירידה דרסטית בת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grants NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 and P50-GM076516
Materials
| Name | Company | Model |
| Lysotracker DND 26 | Life technologies | L-7526 |
| tubuline tracker Green | Life technologies | T34075 |
| Mitotracker RED | Life technologies | M7512 |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | |
| Calcite polarize | Melles Griot Glan | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge technologies | M 6350 |
| Dichroic mirror | Chroma technologies | 700 DCSPXR |
| Motorized stage | ASI | MS2000 |
| Piezo | PI | P721-LLQ |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two photon excitation fluorescence microscopy. Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).
- Dupont, A., Lamb, D. C. Nanoscale three dimensional single particle tracking. Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).
- Estrada, L. C., Gratton, E. 3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles. Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).
- Kis-Petikova, K., Gratton, E. Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope. Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).
- Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. 3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells. Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).
- Lund, F. W., Wustner, D. A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility. Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).
- Nath, S., et al. Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid. Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).
- Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).
- Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. 3D particle tracking on the two photon microscope. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
- Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport. Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).
- Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).
