Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama
Summary
In this video protocol we track – at high speed and in three dimensions – fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.
Abstract
Bu Video protokolün amacı, bir modifiye iki-foton mikroskop 1 kullanarak üç boyutlu floresan yörünge parçacık izleme deneyi gerçekleştirmek ve analiz nasıl tartışmaktır. Geleneksel yaklaşımlar (raster tarama veya kare bir yığın tabanlı geniş alan) aksine, 3D yörünge izleme lokalize ve yüksek uzaysal (10 nm doğruluk) ve temporal çözünürlük (50 Hz frekans tepkisi) 3D deplasman ile takip sağlar mikron 2 yüzlerce uzunluğu-ölçeklerde hareketli bir floresan parçacık. Bu yöntem takip edilecek nesnenin etrafında dairesel bir yörünge gerçekleştirmek için bir iki-fotonlu lazer tarama mikroskobu donanım kontrol eden bir geri besleme algoritmasına dayanır: geri besleme mekanizması yer değiştirme kontrol ederek merkezinde floresan nesne koruyacaktır tarama ışın 3-5. Bu tekniğin avantajlarını göstermek için, biz al içinde hızlı bir hareket organelini, lizozom, takipiving hücre 6,7. Hücreler, standart protokollere göre kaplama, ve bir ticari olarak lizozom boya ile boyandı. Biz yaşayan hücrelerin içinde bir 3D yörünge izleme deneyi gerçekleştirmek için, kısaca donanım yapılandırması ve daha detaylı kontrol yazılımı tartışmak. Ayrıntılı olarak tarama mikroskobu kontrol ve parçacık etrafında kapalı bir yörüngede kirişin hareketi mümkün kılmak için gerekli parametreleri tartışırlar. Bu yöntem etkili bir şekilde canlı hücre içinde 3D mikrotübüller boyunca bir etiketli lizozom hızlı hareketi izlemek için nasıl kullanılabileceğini gösteren sonucuna varmaktadırlar. Lizozomlar tipik olarak mikrotübül ağı 8 boyunca yönlendirilmiş hareketini görüntüleyen, 0.4-0.5 mm / sn aralığında hızlarla hareket edebilir.
Introduction
Yaklaşımlar çok sayıda, bir mikroskop kullanılarak üç boyutlu olarak floresan parçacıkların izlemek için bugüne kadar geliştirilmiştir. En ideal yaklaşımlar, tipik olarak, eksenel yönde izleme elde etmek için mikroskop emisyon optik özel modifikasyonları ile birlikte, iki boyutlu izlemek için uygun, hızlı kameraların kullanımına dayanmaktadır. Bu işlem, uygun bir zaman çözünürlüğü (10 Hz), tipik olarak zaman alıcı ve verir, ancak geleneksel bir partiküldür izlenen halinde, Z yığınlarının bir zaman dizisi gerçekleştirerek, floresan partikül izleyebilir (konfokal ya da iki ya da foton) lazer tarama mikroskobu Etkin bir geri besleme mekanizması 2 ile küçük bir raster görüntüleme bölgenin merkezinde tuttu.
Kilitleme-in parçacığa fikri yörünge izleme yönteminin temelidir. Bunun yerine, bir raster dairesel bir yörünge floresan de yaklaşık tarama gerçekleştirilir. Boyunca floresans yoğunluğuyörünge tam parçacık pozisyonunu 4 lokalize.
Parçacığın lokalize konumu daha sonra mikroskop tarayıcıları ve yeniden merkezi partikül yörünge konumu üzerinde harekete geçirmek için kullanılabilir. Mikroskop galvanometre tarayıcılar bir analog voltaj ile tahrik edilmektedir. Bu gerilimin AC bileşeni, bir sinüs ve dairesel bir yörünge performans sağlayacak X ve Y, tarama ayna uygulanan bir kosinüs dalgası, yani, odaklı lazer ışını ile bir yörüngeye da yapılabilir. Sinyalinin offset DC yörünge merkezinin pozisyonunu değiştirerek kolaylaştırır. Bir yörünge süresi belirlenir ve AC sinyali için dalga yapılandırıldıktan sonra, geri besleme sistemi bir sinyalin DC bileşenini güncellemek gerekir.
Dedektörler toplanan floresan sinyalini okumak mümkün bir yazılım DC kapalı, tarayıcılar ve dedektörleri kontrol etmek parçacığın konumunu hesaplamak için ve güncelleme gereklidirayarlayın. Yörünge parametrelerine (boyut ve zamanlama) dikkatli bir seçim görüntüleme başarılı bir geribildirim için gerekli ve bu parametreler o izlemek için gerekli olan floresan parçacıkların özelliklerine dayalı ayarlanması gerekiyor edilir.
Tekniğinin fiziksel ve matematiksel temelleri 2D ve 3D uygulamaları için geçmiş 4,5'den tarif edilmiştir. Bu protokolde kısaca kurulum ana donanım bileşenlerini tanımlamak ve daha ayrıntılı parametrelerin seçimi ve numune hazırlama canlı bir hücrenin içinde yüksek bir zamansal çözünürlükte bir lizozomun yerinden takip etmemizi sağlayan tipik bir deney için gerekli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yüksek zamansal çözünürlüğe sahip üç boyutlu floresan parçacıkların yörüngeleri elde son yıllarda floresan mikroskopi teknikleri ve instrumentations, muazzam gelişmelere rağmen alanında bir meydan okuma kalmıştır. Yüksek zamansal çözünürlüğü, iki boyutta izleme parçacıkları elde edilmişse, eksenel yöne uzantısı genellikle, sistemin 10 bir frekans yanıtı şiddetli bir azalma getirir.
Bu video protokolde iki foton mikroskop kullanılarak yüksek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grants NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 and P50-GM076516
Materials
| Name | Company | Model |
| Lysotracker DND 26 | Life technologies | L-7526 |
| tubuline tracker Green | Life technologies | T34075 |
| Mitotracker RED | Life technologies | M7512 |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | |
| Calcite polarize | Melles Griot Glan | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge technologies | M 6350 |
| Dichroic mirror | Chroma technologies | 700 DCSPXR |
| Motorized stage | ASI | MS2000 |
| Piezo | PI | P721-LLQ |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two photon excitation fluorescence microscopy. Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).
- Dupont, A., Lamb, D. C. Nanoscale three dimensional single particle tracking. Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).
- Estrada, L. C., Gratton, E. 3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles. Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).
- Kis-Petikova, K., Gratton, E. Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope. Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).
- Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. 3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells. Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).
- Lund, F. W., Wustner, D. A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility. Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).
- Nath, S., et al. Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid. Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).
- Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).
- Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. 3D particle tracking on the two photon microscope. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
- Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport. Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).
- Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).
