Vurdere sekretoriske Kapasitet av bukspyttkjertelen akinærceller

Summary

Isolerte bukspyttkjertelen acini beholde sin in vivo morfologi og aktivitet og tilby effektive måter for å overvåke og manipulere sekresjon. Dette arbeidet viser hvordan acini kan bli isolert fra muse bukspyttkjertelen, og hvordan deres sekretoriske kapasiteter kan vurderes.

Abstract

Bukspyttkjertelen akinærceller produsere og skille ut fordøyelsesenzymer. Disse cellene er organisert som en klynge som danner og deler en felles lumen. Dette arbeidet viser hvordan den sekretoriske evne av disse cellene kan bli vurdert ved dyrking av isolerte acini. Oppsettet er fordelaktig, siden isolert acini, som beholde mange karakteristikker av intakt eksokrin pankreas kan manipuleres og overvåkes lettere enn i hele dyret. Riktig isolering av pankreatisk acini er en viktig forutsetning for at den ex vivo-kultur vil representere in vivo natur acini. Protokollen viser hvordan du isolere intakt acini fra musen bukspyttkjertelen. Deretter blir to komplementære fremgangsmåter for evaluering av pankreatisk sekresjon presenteres. Den amylase sekresjon assay tjener som et globalt mål, mens direkte avbildning av pankreatisk sekresjon tillater karakterisering av sekresjonen ved en sub-cellulær oppløsning. Kollektivt, teknikker preseted her, lar et bredt spekter av eksperimenter for å studere eksokrin sekresjon.

Introduction

Den eksokrin pancreas utgjør mesteparten av massen av pattedyr bukspyttkjertelen og er dedikert til produksjon og sekresjon av fordøyelsesenzymer ^en. Den funksjonelle enhet av eksokrin bukspyttkjertelen, acinus, er en klynge av epitelceller som danner og deler en felles lumen. Ved hormonell eller neuronal stimulering, blir vesiklene er fylt med enzymer transportert til den apikale celleoverflaten, sikring med den og utvise deres innhold inn i hulrommet ^1-3. De utskilte enzymer blir deretter drenert av et koalescerende sett med kanaler inn i tynntarmen, hvor de katalyserer nedbrytingen av maten til næringsstoffer.

Denne videoen viser hvordan intakt acini er isolert fra hele bukspyttkjertelen og hvordan deres sekretorisk kapasitet kan vurderes. Ved hjelp av dette oppsettet er pankreatisk sekresjon kvantifiseres ved å måle den relative mengde av amylase som ble frigjort etter stimulering. Alternativt kan sekresjon avbildes lever ved bruk av forskjelligesensorer og fargestoffer.

Den ex vivo oppsett av pankreatisk acini er fordelaktig, siden isolert acini, som beholde mange egenskaper ved de intakte bukspyttkjertelen, kan manipuleres og overvåkes lettere enn i hele dyret ^4-6. Dette oppsettet ble opprinnelig utviklet på slutten av 1970-tallet og var siden utvidet for studiet av flere eksokrine vev som spytt og brystkjertler ^3-7. Spesielt, innrømmer det studiet av sekresjon med minimal forstyrrelse for de komplekse cellulære organisasjoner av disse polariserte epitel.

Protocol

MERK: prosedyrer som involverer dyr fag har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC) ved Weizmann Institute of Science. 1. Prøvepreparering Isolering av bukspyttkjertelen acini Forbered 300 ml frisk Krebs-Ringer bikarbonat HEPES (KRBH) medium før start. Bland 140 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,16 mM MgCl2, 1 mM CaCl 2, 11 mM glukose, 10 mm HEPES. Legg bovint serumalbumin (BSA) og 0,1 mg / ml soyabønne trypsin-inhibitor (STI) (re…

Representative Results

Bukspyttkjertelen acini som ble isolert skikkelig vise en stereotyp morfologi sett lyset. Deres basolateral domener skal vises rundt og blottet for blebs. Den apikale domenet er omgitt av hundrevis av sekretoriske vesikler og er mørkere i fargen (Figur 2A, B). Kjernene er plassert basal til vesikulært området. Cellerester og komponenter av pankreatisk duktalt systemet og i det endokrine pankreas, som kan detekteres på et tidlig stadium av acini isolert (figur 2C, D), bør være frav…

Discussion

Foruten den ex vivo-kultur, alternativt oppsett for studiet av eksokrin sekresjon omfatter intravital mikroskopi og måling av fluider fra bukspyttkjertelkanalen. Intramikroskopi ble vist seg å fungere godt i musen spyttkjertler ^10. Denne metoden kan ta opp sekresjon i sanntid i intakte dyr, men er begrenset i sin oppløsning og ved at innretningen for å manipulere det eksokrine vev. Vurdere sekresjon ved å samle væske fra bukspyttkjertelen duct ble oppnådd i bedøvede rotter ^11. Imid…

Materials

ICR mice	Harlan		Any strain will do
HBSS	Sigma Aldrich	H8264	Can substitude for KRB
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Fraction V
Trypsin inhibitor	Sigma Aldrich	T9003
Collagenase XI	Sigma Aldrich	C0130
Nylon mesh	BD Falcon	352360	70-100µm
Amylase infinity reagent	Thermo	TR25421
CCK	Sigma Aldrich	C2175
FM4-64	Lifetechnologies	F34653	Diluted to 16µM
20mL scintillation vial	Sigma Aldrich	Z190527
DeltaVision system	Applied Precision		Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)
Zeiss 510 or 710 confocal microscope	Zeiss		60x/1.4 or 100x/1.4 objectives
Ultra Microplate reader	BioTek	ELx808