A Novel<em> In vivo</em> Gene Transfer Teknikk og<em> In vitro</em> Cell Based Analyser for studier av bentap i Muskel-og skjelettplager

Summary

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

Abstract

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

Introduction

Muskel-sykdommer påvirker millioner av mennesker i USA og presentere alvorlige konsekvenser for nasjonale og lokale helsesystemer ^en. Disse lidelser er karakterisert ved tapet av ben-og leddfunksjon som vil kreve omfattende behandling og lange perioder med utvinning. Vanligvis er en relativ økning i antallet og / eller aktiviteten til osteoklaster, celler spesialisert til å resorbere ben, i osteoporose og artritt blir observert ^to. Under fysiologiske betingelser antallet og aktiviteten av osteoklaster er regulert av reseptor aktivator av nukleær faktor κ-B ligand (RANKL), som er produsert av osteoblaster. Osteoprotegerin (OPG), er en lokkedue reseptor for RANKL også produsert av osteoblaster ³ In vivo dyremodeller som involverer systemisk overekspresjon av sRANKL, eller sletting av OPG er svært verdifull i osteoporose forskning.; Imidlertid er disse metoder krever generering av transgene mus ^4,5. Her en ny alternativmetode for overekspresjon sRANKL for studiet av muskel-relaterte lidelser er beskrevet. Spesielt ble minicircle (MC) DNA-teknologi og hydrodynamiske levering metoder som brukes for å oppnå genoverføring av sRANKL in vivo og overuttrykker mus sRANKL systemisk ^seks.

Denne metoden er også komplementære til andre in vivo-modeller av osteoporose, slik som hormonelle modulering av osteoklaster etter ovariektomi ⁷ og kost inngrep med lavt kalsium diett ^8.. Disse modellene er svært nyttig å studere ulike aspekter av muskel-relaterte lidelser, men de krever kirurgiske prosedyrer, og kan ta opp til flere måneder, til en betydelig kostnad ^ni. Ovariektomiserte (OVX) gnagermodellen er en eksperimentell dyremodell, hvor fjerning av eggstokkene fører til østrogenmangel derved å etterligne humant postmenopausal osteoporose ^10.. Menneskelig postmenopausal osteoporose, en tilstand der østrogen deficiency fører til økt risiko for benbrudd og osteoporose påvirker om lag åtte millioner kvinner i USA alene. Selv om OVX modellen er nyttig for postmenopausal osteoporose det gir begrensede fordeler i å studere osteoporose generelt. Østrogen undertrykker bentap, ved å fremkalle osteoklast og hemme osteoblast apoptose, derfor i sitt fravær økt osteoklastaktiviteten er observert ^10-12. En RANKL-OPG ratio ubalanse som favoriserer benresorpsjon er også observert ^13. Imidlertid er østrogenmangel in vivo også ledsaget av reduserte nivåer av transformerende vekstfaktor β (TGF β), økt interleukin-7 (IL-7) og TNF, IL-1 og IL-6 ^14,15. Som disse cytokiner er kjent bein remodeling regulerende funksjoner uavhengig av RANKL veien, er det umulig å tilskrive noen osteoklast aktivering utelukkende til RANKL-RANK aksen. Modellen er beskrevet i denne artikkelen gjør forskerne å studere i vivo RANKL-RANG aksen i osteoclastogenesis og bentap uten proinflammatoriske cytokiner forhold til OVX gnager modeller.

I tillegg, in vitro osteoclastogenesis teknikker er viktige verktøy for å studere osteoklast aktivering for potensielle terapeutiske behandlinger av muskel-og skjelettsykdommer. Tidligere studier har også vist at dyrking mus benmarg avledet makrofager (BMMs) med musemakrofag koloni-stimulerende faktor (M-CSF) og mus sRANKL kan føre til osteoklast differensiering ^3,16,17. Her er de protokoller generere multinucleated osteoclast lignende celler fra mus beinmarg samt fra humane perifere mononukleære blodceller (PBMCs) in vitro ¹⁸ beskrevet. De celle-baserte analyser som kreves for å definere en moden terminalt differensiert og fullt funksjonell osteoklastmediert er også kort beskrevet. Disse in vitro teknikker utfylle romanen in vivo tilnærming og sammen fungere som powerful undersøkende verktøy for å studere osteoklast differensiering og aktivering. Ved hjelp av disse systemer, har forskere i stand til å generere osteoklaster in vivo og in vitro, og definere stimuli og signaler som er nødvendige for deres proliferasjon og aktivering så vel som tester effektiviteten av farmakologiske og biologiske inhibitorer.

Protocol

En. Hydrodynamisk Levering av sRANKL MC DNA Hydrodynamisk levering via Mouse Tail Vein Vei musen før halevene-injeksjon. Fortynn sRANKL eller grønt fluorescerende protein (GFP) MC i Ringers løsning (pre-varm til 37 ° C) i et totalvolum på ~ 10% av musekroppsvekt. Varm opp mus i et bur i 10 min før injeksjon for å utvide blodårene og gjør lateral årer (LVS) synlige. Overvåk musen nøye for å unngå dehydrering og hypertermi. Så snart de LVS er utvidede og synlige, over…

Representative Results

Her blir en ny genoverføring teknikk for differensiering av osteoklaster in vivo-og cellekultur-protokoller for å differensiere forløper celler i osteoklaster in vitro som en fremgangsmåte for å studere effektene av cytokiner på osteoclastogenesis beskrevet. I figur 1, er de representative resultater for vellykket genoverføring av GFP og mus sRANKL MC i mus er vist. I figur 2, er de representative bilder av benmarg fra mus eller human PBMC celledifferensiering t…

Discussion

Muskel-forholdene er ledende årsakene til sykelighet og uførhet og består av over 150 sykdommer og syndromer; berører om lag 90 millioner amerikanere i dag. Leddbetennelse og bein ødeleggelse er dominerende trekk ved muskel-forhold, blant annet leddgikt og osteoporose. Osteoporose er en tilstand som svekker bein integritet, ofte fører til brudd i benet. Leddgikt er en kronisk, svekkende sykdom karakterisert ved betennelse i leddene som blir hovne, ømme og stive begrensende normal bevegelse og kan føre til uførh…

Materials

alpha-MEM	Life Technologies	12561-056
Human M-CSF	Miltenyi Biotec	130-096-492
Mouse M-CSF	Miltenyi Biotec	130-094-643
Human RANK-Ligand – soluble	Miltenyi Biotec	130-094-631
Mouse RANK-Ligand – soluble	Miltenyi Biotec	130-094-076
Tailveiner Restrainer for mice	Braintree	TV-150 STD
Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit	R&D systems	MTR00
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma	387A
MouseTRAP assay	immunodiagnostic systems	SB-TR103