אנו מדווחים טכניקה לייצור של micropockets בתוך ממברנות electrospun בי ללמוד התנהגות תא. באופן ספציפי, אנו מתארים שילוב של microstereolithography וelectrospinning לייצור PLGA (פולי (lactide-CO-glycolide)) ההתקנים ביולוגי קרני מצוידים בmicrofeatures.
בעיות בקרנית משפיעות על מיליוני אנשים ברחבי העולם ולפגום באיכות חיים שלהם באופן משמעותי. מחלה בקרנית יכולה להיגרם על ידי מחלות כגון Aniridia או סטיבן ג'ונסון תסמונת, כמו גם על ידי גורמים חיצוניים כגון כוויות כימיות או הקרנות. טיפולים הנוכחיים (i) השימוש בשתלים בקרנית וכן (ii) השימוש בתאי גזע הרחיבו במעבדה ונמסרו על ספקים (למשל, קרום מי שפיר); טיפולים אלה בהצלחה יחסית, אך למרבה הצער הם יכולים להיכשל לאחר 3-5 שנים. יש צורך לתכנן ולייצר מכשירים בחומר ביולוגי של קרנית חדשים מסוגלים לחקות בפירוט את הסביבה הפיזיולוגית שבו תאי גזע נמצא בקרנית. תאי גזע limbal ממוקמים בימבוס (האזור העגול בין קרנית ולובן עין) בנישות ספציפיות הידועות כPalisades של וגט. בעבודה זו פיתחנו פלטפורמה טכנולוגית חדשה המשלב את שתי טכניקות ייצור חדשניות (microstereolithography וelectrospinning) עבור הייצור של ממברנות של קרנית המחקות לימבוס במידה מסוימת. ממברנות שלנו מכילות micropockets המלאכותי שמטרתם לספק הגנת תאים כPalisades של וגט לעשות בעין.
הקרנית, רוב הרקמות החיצוניות המרכזיות avascular של העין, היא אחת הרקמות החשובות ביותר מעורבות בחזון 1. ישנם מספר סוגים של תאים השומרים על התפקוד של הקרנית. השכבה החיצונית ביותר העליונה של הקרנית מורכבת מתאי האפיתל שיכול להיות על 5-7 שכבות בעובי 2. שכבה זו מונעת פלישת חיידקים לתוך הקרנית 3 ומאפשרת כניסה של חמצן 4. זה כבר דווח כי תאי הגזע של שקר קרנית אפיתל בנישות או מאורות (עם גדלים של 120-150 מיקרומטר) באזור הפריפריה של הקרנית הידוע בשם 5,6 ימבוס. כתאי הגזע מתחלקים, תאי הבת המכונים גם תאי הגברה חולפים לנסוע אל מחוץ לנישות וכחטיבה ממשיכה התאים לנוע centripetally פנימה וכלפי מעלה וכתוצאה מכך תאי סופני מובחנים באזור קרני המרכזי 7,8. תאים אלה מחו באופן שגרתי כהרף עין האלקטרוניxposing תאים חדשים יותר מתחת 9.
בנוסף להיות המיקום של תאי גזע אפיתל, לימבוס גם משחק תפקיד בשמירה על כלי הדם בלחמית מאזור הקרנית 10. נזק לימבוס יכול להיגרם על ידי כוויות תרמיים / כימיות, קרינה וגם מחלות גנטיות 10. כאשר זה קורה, את מחסום ימבוס מתפרק מאפשר לתאי הלחמית להעביר על גבי הקרנית, vascularizing האזור, בגרימת כאב ועיוורון במקרים מסוימים. המצב ידוע כחסר בתאי גזע limbal (LSCD) 10.
מצעים טבעיים שונים דווחו כנישאי תאי גזע אפשריים לסיוע בהתחדשות של קרנית. לדוגמא, קרומים המבוסס על קולגן שמשו Dravida et al. 11 וראמה ועמיתים לעבודה 12 דיווחו על השימוש בהפיברין במחקר עם 112 חולים. כיום לעומת זאת השיטה הנפוצה ביותר של טיפולהוא להשתמש בקרום מי שפיר אנושי מבנק רקמות ותאי אפיתל limbal תרבות על פני השטח שלו 13,14. ברגע שmonolayer יצר, הקרום מי השפיר מודבק תא בצד לעלות על הקרנית הפגומה שבה יש את כל תאי הלחמית ורקמת צלקת הוסרו בניתוח ממנו לפני השתלת תאים זה 14. הקרום מי שפיר מדרדרת בתוך שבועות עד חודשים עוזבים את תאי האפיתל שצורפו לאזור הערום להתחדש האפיתל 15,16. טכניקה זו נוסתה בהצלחה בשיקום ראייה עם זאת יש עדיין כמה סוגיות מעשיות המגבילות את הספיגה הנרחבת שלה מבחינה קלינית. כקרום מי השפיר היא רקמה אנושית שהוא צריך לעבור בדיקות סקר באמצעות נהלי בנקאות רקמה טובים לפני שמשמש להשתלת תאים בחולים. הקרנה זה מורידה רק את הסיכון להעברת מחלות, אך לא יכולה לחסל אותו לחלוטין 17. בנוסף לכך היו דיווחים של השתנות בעמ 'erformance של הקרום מי השפיר עקב וריאציה בין תורם 18,19 ושיטות עיבוד שונים 19,20. לצד הקטן הסיכון להעברת מחלה יש דרישה למרכזי כירורגיים גישה לבנקי רקמות מנוהלים היטב, אינו זמינים לכל.
למרות שהקרום מי השפיר הוא מוצלח יחסית, יש צורך בפיתוח של חלופות חדשות סינתטיות מתכלות תא ספק לטיפול במחלה בקרנית. ספקים סינטטיים יהיו להתגבר על הצורך בבנקאי נהלים כמו גם ביטול הקטן סיכון להעברת מחלה ולהבדלים בין תורם. במובן זה, חומרים כגון 21,22 פוליאתילן גליקול וPLGA 23,24 נחקרו.
בפיתוח אלטרנטיבה סינתטית לקרום מי שפיר האדם יש גם האפשרות לעצב לתוכו תכונות רצויות בתקווה לעזור להישרדות של התאים בתרבית. Inclusion של microfeatures בתוך מכשירים ביולוגי לשליטה מסוימת של התנהגות תא הוא אזור מתפתח של עניין. מחברים רבים דיווחו עבודה לקראת הפיתוח של תאי גזע מלאכותיים נישות 25-30. קבוצה זו לאחרונה דיווחה יצירת ימבוס microfabricated PEGDA-biofunctionalized פיברונקטין המלאכותי עבור המשלוח של תאי האפיתל limbal 22 והמתודולוגיה לייצור של ממברנות מתכלות electrospun המכילות כיסי microfabricated לתמיכה של תאי אפיתל limbal יום 31.
מטרת עבודה זו היא לפתח טכנולוגיית ייצור חדשה לפיתוח של התקנים ביולוגי המכילים microfeatures המחקה במידה microenvironments בי תאי גזע מתגוררים בגוף. פיתחנו טכניקה המשלבת microstereolithography וelectrospinning המאפשרת הייצור של ממברנות microstructured מתכלות שמראות greaפוטנציאל t עבור יישומי התחדשות רקמות.
זה חשוב לשים לב שלמרות שבעבודה זו טכניקה זו הוחל הייצור של טבעות להתחדשות קרנית, הטכנולוגיה יכולה להיות מיושמת על הייצור של מכשירים להתחדשות של מגוון רחב של רקמות אפיתל, למשל, עור, דרך הפה epithelia רירית, מעי, בדרכי הנשימה, ושלפוחית שתן. באופן ספציפי, במחקר זה פיתחנו קרום מתכלה סינטטי המתפקד באופן דומה לקרום מי השפיר, כדי לספק לתאי הקרנית. קרום זה מכיל micropockets של כ 300 מיקרומטר (גדול יותר ממאורות limbal של Pallisades של וגט (150 סביב מיקרומטר)). לבסוף, הקמנו פרוטוקול אריזה המאפשר הקרומים האלה להיות מאוחסנים ב-20 מעלות צלזיוס למשך יותר מ -6 חודשים בלי להראות שום סימנים של התמוטטות.
מחקר זה מתאר (א) טכניקה לייצור של ממברנות electrospun מכיל microfeatures בתוכם וכן (ב) כיצד להכין קרומים כאלה לשימוש קליני על ידי אריזת ואקום, קרינת גמא ולאחר מכן אחסון לפני שימוש. ביישום מסוים זה פיתחנו ממברנות PLGA מכילות micropockets המחקה את התכונות הפיזיות של הנישות של תאי גזע limbal. מטרותיו של מחקר זה הן (i) כדי לתאר את השיטות לספק לקוראים עם הידע הדרוש כדי לתכנן ולייצר פיגומים המכילים microfeatures לחקר התרומה של נישות של תאי גזע להתחדשות רקמות וכן (ii) כדי לספק את הקורא עם הבנה טובה יותר כיצד לאחסן פיגומי electrospun לפרקי זמן ארוכים.
במונחים של יישום קליני, האחסון של קרומי הטבעת הוא בעלת חשיבות עליונה. בעבודה זו, את ההשפלה של הטבעת נחקרה על פני תקופה של 6 חודשים. השפלה שלקרומים הוא מונעים על ידי הידרוליזה כך פשוט על ידי שמירה על ממברנות לחות ללא התהליך נעצר. בלקווד et al. דיווח כי על ידי שינוי היחס של PLA לPGA, השפלה של הקרום משתנה 32. מחקר זה הראה גם כי על ידי הגדלת הכמות של PGA, קצב הפירוק של קרומי electrospun מוגבר in vivo 22. כאן זה כבר הראה כי עם ואקום אריזת הקרומים יחד עם כמה יבוש והקרנתם ואחסונם בטמפרטורות נמוכות למשך 6 חודשים, אין שינוי בשלמות הסיבים והשפלה. נכון לעכשיו, 6 חודשים הוא ככל שלמדנו עם הקרומים האלה מכילים micropockets אבל נתונים אחסון לשנה 1 דווחה על קרומי electrospun רגילים ב -20 מעלות צלזיוס 22 ועכשיו יש לנו נתונים שלא פורסמו לאחסון שלהם ב -20 ° C 2 שנים ללא כל סימנים של השפלה. כך עבור אחסון לטווח ארוך זה יהיה מומלץ לאחסן אותם יבש ב-206; C אבל זה אפשרי לאחסן אותם ב RT גם בהודו במשך לפחות 6 חודשים (ואולי עוד הרבה זמן). הכללתו של מדד לחות נותנת אמצעי קל של בדיקת שהאריזה שמרה קרומים יבשים ובמקרה כזה הם יהיו כשירים לצורך.
העברה של תאים מטבעות אלה לדגמי קרנית 3D הוצגה בעת ביצוע explants limbal בתוך micropockets. קבוצה זו דיווחה לאחרונה על העברה של תאים על במבחנה מודל קרנית ארנב על ידי הצבת explants על קרומי PLGA רגילים (ממברנות ללא מבני טבעת) 24. באמצעות העברת תא פיגומי microfabricated הנוכחית כבר נלקח צעד אחד קדימה כפי שאנו יכולים כעת באופן ספציפי לאתר explants רקמה בתוך microfeatures. היכולת להציב explants ישירות בתוך הנישות גם מאפשרת למנתח להשתמש בממברנות ישירות בתיאטרון כירורגית למנוע את הצורך של חדר נקי לראשון להרחיב את תאי גזע limbal. למרות שפיסת wor זהk כבר מתמקד בפיתוח התקנים לטיפול במחלת קרנית, טכנולוגית microfabrication זה יכול להיות מיושמת גם לפיתוח מכשירים ליישומים רבים אחרים. לעבוד בעתיד יהיה לחקור את הייצור של מבנים להתחדשות של רקמות אחרות כגון עור ועצמות.
בעוד העיצוב והייצור ראשוני של microstructures PEGDA יכולים להיות זמן רב, פעם אחת מפוברק ניתן לעשות שימוש חוזר במבנים פעמים רבות ללא השפלה. לכן, הייצור הבא של ממברנות מתכלות PLGA microstructured ידי electrospinning יכול להתבצע בקצב דומה לייצור של ממברנות רגילים ('בלתי מובנים') בעקבות ההרכבה של האספן. למרות בעבודה זו השתמשנו microstereolithography עבור בודה התבניות, שיטות ייצור אחרות כגון 3D-הדפסה או הזרקה יכולות לשמש גם. בהתאם לכך, העובש שבבסיס יכול להיות עשויים מפולימרים או מתכות אחרים במקום PEGDA. ככזה בטכניקה זו היא מאוד תכליתית וחוקרים יכולים בקלות להתאים את השיטה כדי להתאים לצרכימים שלהם ומתקנים.
הגדרת microstereolithography הבית ב- שימשה במחקר זה לא יאפשר ההכנה של מבנים עם תכונות תחת 30μm; זו היא לא מגבלה עבור היישום קרני שתואר כאן, אבל זה יכול להיות מכריע בעיצוב של דגמים אחרים. שבטכניקות אחרות מקרה פילמור כגון 2 פוטון (2PP) יכול להיות עניין עם זאת טכניקת electrospinning יכולה שלא לאפשר הרבייה של מבנים בקנה המידה תת מיקרון (היום זה נחקר על ידי הקבוצה שלנו).
שלבים קריטיים בתהליך הייצור הם (i) הימנעות overcuring של תבניות PEGDA אשר יכול להיות נשלטו על ידי התאמת זמן וכמויות של photoinitiator. (Ii) שליטה תנאי electrospinning כגון טמפרטורה ולחות. (Iii) אחסון כראוי electrospuקרומי טבעת n באמצעות ואקום ומוצרי החלב וdesiccants.
לסיכום, על ידי הצבת explants רקמת limbal בתוך microfeatures של הקרום שהראינו תוצאה תא מexplants על תחומי נישה, העברת תאים על גבי קרנית נפצעה ארנב ומחדש epithelization הבא של הקרנית. השפלה של הקרומים המאוחסנים בטמפרטורות שונות גם נחקרה ופרוטוקול אריזה המאפשר אחסון לטווח הארוך של ממברנות פותח, האחרון להיות חיוני בפיתוח ממברנות לשימוש קליני.
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.
Name of reagents/material/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Poly lactic-co-glycolic acid | Purac | PDLG5004 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser |
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250g/mol 500 ml |
DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
Ham’ s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
EGF | R&D | 236-EG-200 | |
Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
gamma- irradiation (Sterilisation) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) – external dose range of 25-40KGy | N/A | |
Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
Copper (II) sulphate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | N/A | |
Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | N/A | |
Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | N/A | 3% |