Se presenta una técnica para la fabricación de membranas microbolsas dentro electrohiladas en el que estudiar el comportamiento celular. Específicamente, se describe una combinación de microstereolithography y electrospinning para la producción de PLGA (poli (lactida-co-glicólido)) dispositivos de biomateriales corneales equipados con microfeatures.
Problemas corneales afectan a millones de personas en todo el mundo, reduciendo su calidad de vida significativamente. Enfermedad de la córnea puede ser causada por enfermedades como la aniridia o síndrome de Steven Johnson, así como por factores externos tales como quemaduras químicas o radiación. Los tratamientos actuales son (i) el uso de injertos de córnea y (ii) el uso de células madre expandida en el laboratorio y entregado en soportes (por ejemplo, de membrana amniótica); estos tratamientos son relativamente exitoso, pero lamentablemente pueden fallar después de 3-5 años. Hay una necesidad de diseñar y fabricar nuevos dispositivos de biomateriales capaces de imitar la córnea en detalle el entorno fisiológico, donde las células madre residen en la córnea. Células madre del limbo se encuentran en el limbo (área circular entre la córnea y la esclerótica) en nichos específicos conocidos como los Palisades de Vogt. En este trabajo se ha desarrollado una nueva tecnología de plataforma que combina dos técnicas de fabricación de última generación (microstereolithography y electrospinning) para la fabricación de membranas de la córnea que imitan a un cierto punto del limbo. Nuestras membranas contienen microbolsas artificiales cuyo objetivo es proporcionar células con protección que el Palisades de Vogt hacer en el ojo.
La córnea, el tejido avascular más exterior central del ojo, es uno de los tejidos más importantes que intervienen en la visión 1. Hay varios tipos de células que mantienen la función de la córnea. La capa más externa superior de la córnea se compone de células epiteliales que pueden ser alrededor de 5-7 capas de espesor 2. Esta capa evita la invasión bacteriana en la córnea 3 y permite la entrada de oxígeno 4. Se ha informado de que las células madre de la mentira epitelio corneal en nichos o criptas (con tamaños de 120-150 micras) en la región periférica de la córnea conocido como el limbo 5,6. Como las células madre se dividen, las células hijas también conocidas como células de amplificación transitorias viajan fuera de los nichos y como la división sigue las células se mueven de forma centrípeta hacia dentro y hacia arriba resultante en las células terminalmente diferenciadas en la región central de la córnea 7,8. Estas células se limpian rutinariamente lejos con un abrir y cerrar de los ojos exposing células nuevas debajo de 9.
Además de ser la localización de las células madre epiteliales, el limbo también juega un papel en el mantenimiento de la conjuntiva vascularizado lejos de la región de la córnea 10. Daños en el limbo puede ser causada por quemaduras térmicas / químicas, la radiación y también enfermedades genéticas 10. Cuando esto sucede, la barrera limbo se descompone permitiendo que las células conjuntivales y mueva sobre la córnea, vascularizante la región, causando dolor y ceguera en algunos casos. La condición se conoce como insuficiencia límbica (SIL) 10.
Diferentes sustratos naturales han sido reportados como posibles portadores de células madre para ayudar en la regeneración de la córnea. Por ejemplo, las membranas a base de colágeno fueron utilizados por Drávida et al. 11 y Rama y compañeros de trabajo 12 informaron el uso de fibrina en un estudio con 112 pacientes. En la actualidad, sin embargo el método más comúnmente usado de tratamientoes el uso de la membrana amniótica humana a partir de un banco de tejidos y el cultivo de células límbicas en su superficie 13,14. Una vez que se ha formado una monocapa, la membrana amniótica se pega lado célula arriba sobre la córnea dañada que tiene todas las células conjuntivales y tejido de cicatriz extirpado quirúrgicamente de ella antes de este trasplante de células 14. La membrana amniótica se degrada en cuestión de semanas a meses dejando las células epiteliales unidas a la zona despojada de regenerar el epitelio 15,16. Esta técnica ha tenido éxito en la restauración de la visión, sin embargo todavía hay algunas cuestiones prácticas que restringen su adopción generalizada clínicamente. A medida que la membrana amniótica es un tejido humano que tiene que someterse a cribado utilizando los buenos procedimientos de bancos de tejidos antes de utilizarse para el trasplante de células de los pacientes. Esta selección sólo reduce el riesgo de transmisión de enfermedades, pero no puede eliminar por completo 17. Además de esto ha habido informes de la variabilidad en el pendimiento de la membrana amniótica debido a la variación de los donantes entre 18,19 y 19,20 diferentes métodos de procesamiento. Junto con el pequeño riesgo de transmisión de enfermedades existe el requisito de que los centros quirúrgicos para tener acceso a los bancos de tejidos bien administradas, que no están disponibles para todos.
Aunque la membrana amniótica es relativamente exitosa, hay una necesidad para el desarrollo de nuevas alternativas de soporte de células biodegradables sintéticos para el tratamiento de la enfermedad de la córnea. Portadores sintéticos superarían la necesidad de procedimientos bancarios, así como eliminar el pequeño riesgo de transmisión de enfermedades y la variabilidad entre los donantes. En este sentido, se han estudiado materiales tales como polietilenglicol 21,22 y 23,24 PLGA.
En el desarrollo de una alternativa sintética a la membrana amniótica humana también existe la posibilidad de diseñar en él características deseables para ayudar esperemos que la supervivencia de las células cultivadas. El inclusion de microfeatures dentro de los dispositivos de biomateriales para el control específico de la conducta celular es un área emergente de interés. Muchos autores han descrito el trabajo hacia el desarrollo de células madre artificiales nichos 25-30. Este grupo ha informado recientemente la creación de un PEGDA fibronectina-biofuncionalizadas limbo artificial microfabricado para la entrega de las células epiteliales del limbo 22 y una metodología para la fabricación de membranas biodegradables que contienen bolsillos electrospun microfabricados para el apoyo de las células epiteliales del limbo 31.
El objetivo de este trabajo es el desarrollo de una nueva tecnología de fabricación para el desarrollo de dispositivos de biomateriales que contienen microfeatures que imitan hasta el punto de los microambientes en el que las células madre se encuentran en el cuerpo. Hemos desarrollado una técnica que combina microstereolithography y electrospinning que permite la fabricación de membranas microestructurados biodegradables que muestran great potencial para aplicaciones de regeneración tisular.
Es importante notar que, aunque en este trabajo esta técnica se ha aplicado a la fabricación de anillos para la regeneración de la córnea, la tecnología se puede aplicar a la fabricación de dispositivos para la regeneración de una amplia gama de tejidos epiteliales, por ejemplo, piel, orales epitelios mucosa, intestino, respiratorias, y de la vejiga. Específicamente, en este estudio hemos desarrollado una membrana biodegradable sintético que funciona de una manera similar a la membrana amniótica para administrar células a la córnea. Esta membrana contiene microbolsas de alrededor de 300 micras (más grande que las criptas del limbo de los Pallisades de Vogt (alrededor de 150 micras)). Finalmente, se ha establecido un protocolo de envasado que permite a estas membranas para ser almacenadas a -20 ° C durante más de 6 meses sin mostrar ningún signo de descomposición.
Este estudio describe (a) una técnica para la fabricación de membranas electrohiladas contiene microfeatures dentro de ellos y (b) cómo preparar tales membranas para uso clínico por el envasado al vacío, radiación gamma y después de almacenamiento antes de su uso. En esta aplicación particular hemos desarrollado membranas que contienen PLGA microbolsas que imitan las características físicas de los nichos de células madre del limbo. Los objetivos de este estudio son: (i) describir los métodos para proporcionar a los lectores con los conocimientos necesarios para diseñar y fabricar andamios que contienen microfeatures para la investigación sobre la contribución de los nichos de células madre para la regeneración de tejidos y (ii) a proporcionar al lector una mejor comprensión de cómo almacenar los andamios electrospun durante largos períodos de tiempo.
En cuanto a la aplicación clínica, el almacenamiento de las membranas del anillo es de suma importancia. En este trabajo, se estudió la degradación del anillo durante un período de 6 meses. La degradación de lamembranas es impulsado por hidrólisis de manera simplemente manteniendo las membranas sea detenido libre de humedad del proceso. Blackwood et al. Informó que mediante la variación de la proporción de PLA a PGA, la degradación de la membrana cambia 32. Este estudio también mostró que al aumentar la cantidad de PGA, la tasa de degradación de las membranas electrospun aumentó in vivo 22. Aquí se ha demostrado que con las membranas de embalaje de vacío junto con algo de desecante y la irradiación de ellos y su almacenamiento a bajas temperaturas durante 6 meses, no hay ningún cambio en la integridad y la degradación de la fibra. En la actualidad, 6 meses es por lo que hemos estudiado con estas membranas que contiene microbolsas pero los datos de almacenamiento durante 1 año ha sido reportado en las membranas electrohiladas llano a -20 ° C 22 y ahora tenemos datos no publicados para su almacenamiento a -20 ° C durante 2 años sin ningún signo de degradación. Así, para el almacenamiento a largo plazo sería recomendable almacenarlas en seco a -206; C, pero es posible almacenarlos a temperatura ambiente incluso en la India durante al menos 6 meses (posiblemente mucho más tiempo). La inclusión de un indicador de humedad da una forma fácil de comprobar que el embalaje ha mantenido membranas secas en cuyo caso serán aptos para el propósito.
La transferencia de células de estos anillos a los modelos 3D de córnea se muestra al colocar los explantes del limbo dentro de los microbolsas. Este grupo informó recientemente de la transferencia de células en un modelo de córnea de conejo in vitro mediante la colocación de los explantes de PLGA de fricción en las membranas (membranas sin estructuras de anillo) 24. Usando la presente transferencia de células andamios microfabricados se ha dado un paso más ya que ahora podemos ubicar específicamente explantes de tejido dentro de los microfeatures. La capacidad de colocar los explantes directamente dentro de los nichos también permite al cirujano usar las membranas directamente en el quirófano evitando la necesidad de una sala limpia para expandir primero las células madre del limbo. Aunque este pedazo de work se ha centrado en el desarrollo de dispositivos para la enfermedad de la córnea, esta tecnología de microfabricación se puede aplicar también para los dispositivos para muchas otras aplicaciones en desarrollo. El trabajo futuro se explorará la fabricación de construcciones para la regeneración de otros tejidos como la piel y los huesos.
Si bien el diseño y la fabricación inicial de las microestructuras PEGDA puede llevar mucho tiempo, una vez fabricado las estructuras se pueden reutilizar muchas veces sin degradación. Por lo tanto, la posterior fabricación de membranas biodegradables de PLGA microestructurada por electrospinning se puede realizar a una velocidad comparable a la producción de membranas ('no estructurados') de fricción tras el montaje del colector. Aunque en este trabajo se han utilizado microstereolithography para fabricar los moldes, se podrían también utilizar otros métodos de fabricación, tales como 3D-impresión o de moldeo por inyección. En consecuencia, el molde subyacente podría estar hecho de otros polímeros o metales en lugar de PEGDA. Como tal, esta técnica es muy versátil y puede adaptarse fácilmente a los investigadores el método para que coincida con sus propias necesidades y las instalaciones.
La casa en-microstereolithography configuración utilizada en este estudio no permitirá la preparación de construcciones con características menores de 30 micras; esto no es una limitación para la aplicación de la córnea se describe aquí, pero podría ser crucial en el diseño de otros modelos. En ese caso otras técnicas tales como 2 polimerización de fotones (2PP) podría ser de su interés, sin embargo la técnica de electrospinning podría no permitir la reproducción de las estructuras en la escala inferior a la micra (esto está siendo estudiado por nuestro grupo).
Los pasos críticos en el proceso de fabricación son (i) Evitar la sobrecuración de las plantillas de PEGDA que pueden ser controlados por el tiempo y cantidades de fotoiniciador de ajuste. (Ii) controlar las condiciones de electrospinning tales como la temperatura y la humedad. (Iii) Almacenar adecuadamente la electrospumembranas anillo n utilizando envasado al vacío y desecantes.
En resumen, mediante la colocación de explantes de tejido del limbo dentro de los microfeatures de la membrana hemos demostrado crecimiento externo de células de los explantes en las áreas de nicho, la transferencia de células en una córnea de conejo heridos y posterior re-epitelización de la córnea. La degradación de las membranas almacenadas a diferentes temperaturas también se ha estudiado y un protocolo de embalaje que permite el almacenamiento a largo plazo de las membranas se ha desarrollado, siendo este último esencial en el desarrollo de membranas para uso clínico.
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.
Name of reagents/material/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Poly lactic-co-glycolic acid | Purac | PDLG5004 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser |
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250g/mol 500 ml |
DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
Ham’ s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
EGF | R&D | 236-EG-200 | |
Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
gamma- irradiation (Sterilisation) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) – external dose range of 25-40KGy | N/A | |
Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
Copper (II) sulphate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | N/A | |
Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | N/A | |
Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | N/A | 3% |