突变率在通过波动测试测量年轻酿酒酵母细胞被用于预测不同的复制年龄的母细胞的突变频率。磁分选和流式细胞术,然后用于测量实际的突变频率和母细胞的年龄,以确定从预测的突变频率的任何偏差。
酿酒酵母一直是一个很好的模型系统,研究机构和基因组不稳定的后果。从该酵母模型中获得的信息是相关的许多生物,包括人类中,由于DNA修复和DNA损伤应答因子在不同物种以及保守的。然而,S酵母尚未使用,充分满足时代的积累而增加复制(有丝分裂)突变的变化率是否由于技术的限制。例如,酵母复制寿命,通过显微测量涉及的细胞非常小的群体,其中禁止检测罕见的基因突变。遗传方法通过诱导子细胞的死亡以富集母亲细胞群已经被开发,但是总体大小是由与随机突变妥协的选择系统发生的频率仍有限。目前的协议采用磁索尔蒂的优势表面标记的酵母母细胞纳克获得老娘细胞通过表型选择量化罕见的基因突变的足够大的人群。突变率,通过波动测试测量,并且突变频率首先建立了年轻细胞和用于预测在各个复制青睐母细胞突变的频率。突变频率,然后对排序母细胞确定,并且母细胞的年龄是使用通过用荧光试剂,其检测在细胞分裂过程形成在它们的细胞表面芽疤痕染色流式细胞术测定。然后根据细胞分裂,以实验观察到对于给定的复制年龄的母细胞的频率的数量的预测突变频率的比较,可以识别是否有累积突变的速率与年龄有关的变化。这一基本协议的变化提供了手段来调查改变的特定基因功能的影响或在突变的积累特定的环境条件下复制衰老过程中解决机制的基本基因组的不稳定性。
微生物,例如酿酒酵母 ,是优良的模型用于研究的突变率,但这些模型没有被充分利用的细胞有丝分裂的老化过程中,调查突变的累积。突变积累在核基因组中已经假设通过造成的渐进性丧失(或变化)的基因功能1促进老化。使用微生物系统,从而学习机制和突变的积累后果老龄化将大大加快影响这一过程的遗传因素和环境因素,因为浅显的遗传系统,识别和易于量化的微生物罕见的表型变化过程中的能力。 DNA修复因子和DNA损伤应答蛋白是高度保守的跨不同种类2,并且在生物体的老化基本相似性已被确定为生物体等不同的S。酵母的ð哺乳动物3,使它有可能从酵母中研究获得的结果将是相关的许多生物的衰老。
在S老化研究酵母利用衡量时性衰老或细胞复制衰老2老化模型。时性衰老的特征在于存活力的酵母细胞群是在非分裂状态(固定相)的渐进性丧失,由于养分耗竭3。的时间发生的老化模型已用于证明突变的积累而增加4岁时,由于大的细胞群在该模型中容易地得到执行的表型选择的突变体细胞。在这种情况下,突变积累似乎是由生长信号传导途径和氧化应激5的影响,并且每个这些因素是相关的理解在多细胞真核生物3老化。在复制衰老模型利用了不对称divisi在与南酵母母女细胞研究出现了连续的单元格代3老化。酵母复制衰老往往是通过母亲和女儿的细胞,或者更近,通过酵母细胞的小种群的视频显微镜的小种群的显微操作的微流体装置6,7测量。有限的人口规模使这些方法适用于除全基因组信息是从单细胞获得或频率非常高的遗传变化进行测量8有丝分裂过程中的老化研究基因突变的积累甚少。单个细胞的全基因组测序提供了大量的数据集,用于调查的突变积累,但表型选择系统具有提供测量突变率学习机制底层突变积累的装置的重要优点。研究,探讨通过表型选择的haploi突变频率与房价复制衰老期间ð酵母菌株还没有被报道。
突变率是使用波动测试9常用的测量。突变频率值反映细胞窝藏在一个群体中的基因序列的变异的总数。这包括其中独立的突变发生的细胞和那些细胞简单地继承预先存在的突变的任何后代。与此相反,通过波动测试测量突变率表示的是新出现的每个单元产生独立的突变的数目。这些测试通常涉及以低细胞密度接种许多复制培养,以减少在靶序列中添加细胞与预先存在的突变,生长的培养物至接近饱和,并通过在选择性培养基上生长鉴别突变的细胞的可能性。然后,在若干数学模型中的一个用于复制的人口确定突变的细胞的数目来估计i的数ndependent突变增长9期间出现。的独立突变的数量相比较的平均群体大小为突变率的一种量度。在S酵母突变频率和速率是经常使用的URA3和CAN1基因检测,因为丧失功能的突变,这些基因产生可选择的表型。 URA3功能的丧失使细胞的抗5 -氟乳清酸(5-FOA),由于由URA3编码的蛋白质转换成5-FOA成无毒分子10。的CAN1功能丧失使细胞产生耐药性刀豆氨酸,一种有毒的精氨酸类似物,由于CAN1编码的蛋白质运输精氨酸和刀豆氨酸进入细胞11。
遗传和物理分选策略已成功地获得较大的S.种群酵母母细胞,以方便复制性衰老的调查。遗传策略,包括对子代细胞的存活人口中选择聪明的做法。母富集程序(MEP)涉及的β-雌二醇诱导Cre重组酶的表达仅在子细胞中,从而导致该被加工成含有loxP位点12的两个基本的基因女儿特异性破坏。 MEP的菌株通常可在不存在诱导物的生长,但只母细胞将继续分化诱导后,而子细胞会通过细胞周期12的第一进展过程中阻止在M相通常。而此系统还没有被使用的老化过程中,广泛地研究的突变积累,它已被用于研究杂合性丢失,在二倍体酵母菌株的基因组不稳定性的一种相对常见的形式,以及生化改变在老化母细胞13,14。同样,女儿避雷器系统涉及S的女儿特异性表达cereviSIAE URA3基因15。子式避雷器菌株生长正常,直到5-FOA被加入到培养基中,在其中表达的URA3点的子细胞就会死亡,而母细胞继续生长15。这些都是非常有用的系统,丰富的母细胞,但它们依赖于维护构成选择系统的基因功能。在选择系统中的一个或多个部件的随机突变可能导致子细胞逃脱的选择和增殖指数。在环保部的菌株开发,适当的人口规模是确定的,以避免突变的子细胞可能逃脱选择12的外观。然而,这种限制人口规模妥协的基因组不稳定性的罕见形式的检测复制衰老过程。这种限制对人口规模可以部分克服了使用二倍体酵母菌株,每个基因的两个拷贝有助于选拔制度,因为大多数突变很可能是隐性12。然而,使用二倍体菌株的限制,可以容易地检测出相对于那些可以在单倍体酵母细胞中可容易地检测突变事件的类型。
物理分选策略包括母细胞与未标记的子细胞标记细胞表面分离富集母细胞的大量人口。 S的 观察到的细胞表面蛋白(细胞壁蛋白) 酵母子细胞中出芽已经没有利用标记,他们生产16子细胞标记母细胞是新合成的。例如,标记为在其表面上带有生物素的酵母细胞的初始群体可以生长,然后使用抗生物素微珠及磁性分选器16,因为由初始种群中产生的子细胞不包含在其表面上的生物素的子细胞中分离。串行增长和排序允许获得和分析母细胞逐渐年长人群。这个过程已被成功地用于研究酵母13,14,17,18的复制衰老过程中改变细胞生理学和基因表达。当前方法适应这个生物素标记及磁性分选技术为母细胞充实与测量的潜在稀有突变或通过表型选择的检测其他形式的基因组不稳定性的积累的目的。串行生长和物理分选允许突变积累在逐步老年人母细胞的分析,以及在它们的子代细胞种群。突变率每一代的确定允许的预测突变频率来计算对已经历细胞分裂的一个特定号码母细胞。因为预测的频率值是基于预期的增加,由于附加轮的细胞分裂,大幅偏离于所观察到的穆塔蒂上的频率相对于所预测的数值提供证据的累积突变的速率年龄特异性的变化。使用该协议,有对应于上通过流式细胞术结合分析母细胞的细胞分裂位点芽疤痕荧光染色可用于快速地确定有序和无序的人群的年龄分布。附加的荧光试剂,例如那些用于检测活性氧,也可以在此协议中使用。总体而言,该协议使得能够在基因组的不稳定性依赖于年龄的变化与相关性年龄相关的细胞生理变化的模型生物体适合研究了影响衰老相关的基因组不稳定性的遗传和环境因素的潜在有效的分析。
该协议将多种方法,使资源,也可以有效地应用到基因组不稳定性的研究过程中的有丝分裂细胞的老化方法,可以在酿酒酵母中的模型系统。各种各样的实验,通过表型选择,将不同形式的基因组不稳定性可与磁性分选相结合来研究突变或染色体重排的具体形式可能积聚特定年龄的变化。而全基因组测序的方法可以提供关于整个类型与年龄的基因组发生的变化的更多信息,用表型选择系统来获得突变率的测量和优先隔离特定类型的基因变化的能力,是研究机械的重要优势老化相关的基因组不稳定性的方面。精简细胞年龄的决心和潜力,使physiologi平行测量通过流量校准仪的变化提供给关联与在特定的年龄范围等变化的细胞基因组的不稳定性有效的手段。中积累的突变率潜在年龄依赖性变化的测定,需要:1)在年轻细胞群小心判定率,2)准确地确定细胞的年龄,和3),以可靠地丰富母细胞可重复测量的足够大的种群的能力基因组不稳定的晚年。这种方法允许酵母模型系统,以有助于确定负责在速率和/或基因组不稳定性的有丝分裂活性细胞的频率依赖于年龄的变化基本机制。此外,遗传和环境因素可快速评估到年龄相关的基因组不稳定性的贡献。最终,这些特性可能导致该占其中复制衰老过程中的突变累积的方式模型发展。
该方法依赖于通过可选择的表型的出现来检测突变或其他类型的基因组不稳定性的测量这种事件的发生率的能力。然而,创意实验设计可以允许基因组不稳定性的许多方面进行调查。例如,URA3和CAN1基因可以被放置在不同基因组位点来测试基因组位置中的任何影响的结果。具体的非功能基因的等位基因的逆转,以功能基因的等位基因可以测试特定的突变过程。此外,引进的基因或侧翼与重复序列的基因的多个等位基因处于非活动状态,可以通过使用恢复或基因功能的丧失,研究重组事件分别。波动测试以确定这些不同的基因组不稳定事件9率的标准方法。该协议是使用广泛接受的和相对简单的LEA-库尔森位数估计,以确定木塔写化率,以使其更容易被不同的研究人员,即使MSS-最大似然估计方法被认为是用于确定突变率9的最佳方法。在MSS-最大似然估计进行了详细9预先审查,可以作为一种替代方法,但需要更精密的 计算。或者,自由软件来计算与该方法的突变率已经可用22。获得的突变率的重现性的措施,需要注意的实验设计,包括使用足够复制培养,在足够低的初始细胞密度接种培养物的几个方面,通过10,000倍或更多,并选择适当的培养体积用户数量的增加,以使整个细胞群可以被涂布在选择性培养基上。对于后一点,先前描述的公式可用于基于培养睾丸的级分来调节突变率D 9。变异在培养物的生长速率可以复杂化的重现性的突变率的测定,和改性中位数为基础估计可能产生在这样的情况下更可再现的结果最近已描述23。
准确地测量细胞年龄的能力的另一因素是用于建立在老细胞的基因组不稳定性的频率是否与预期值不同,由于事件在年轻细胞中的速率非常重要。我们已经发现WGA染色是优选calcofluor白色染色,无论是在背景和灵活性方面,由于WGA可用共轭到不同的荧光分子。这种灵活性可以与荧光试剂等电池特性同时测量提供更多的机会。最初的工作,建立了WGA染色信号强度和对细胞芽痕相应数量之间的关系,就可以导致更通过流式细胞仪快速测定细胞的年龄。这种方法还允许使用较大的人口规模比将通常检查显微镜,以提高测量的可重复性。虽然所有年龄的测定可通过细胞的显微镜检查进行,我们认为术方法的流程有助于影响年龄相关的基因组不稳定因素的快速筛查。
除了测定细胞年龄可靠,需要考虑到给予的细胞分裂母细胞被允许经历与每一个连续的圆形生长和分选的细胞的数目。使用较小的初始种群大小或更大的培养体积可以使细胞达到所需的细胞密度前进行更多的细胞分裂。例如,其他研究人员已经排序,得到非常老的酵母细胞16,其具有获取旧细胞具有较少experime的明显优点的使用仅两轮NTAL步骤。当考虑是否向增加培养物体积,以使细胞之前完成分拣更多的细胞分裂,记住在细胞上,可以在单个列中待处理的总数量的限制。使用较大的培养物体积的可能需要使用多个列的一个细胞种群进行分类。另外,如果细胞发生少发各种各样/采集点之间的细胞分裂,然后有更多的机会寿命期间观察与预期的突变频率在不同的时间点的偏差。举例来说,使用期限在采样只在早,晚的时间点可能会产生数据表明突变频率的稳定增长,但寿命期间的额外的中间时间取样可能会很快,然后高原表明,突变的频率增加。然而,由于该协议隔离旧母细胞,有机会得到更直接的测量变化的突变率随着年龄的。波动测试可以bê执行使用不同年龄段的母细胞,以确定突变率是否会有所不同使用年轻细胞中获得的速率。而培养这些波动测试将成为古老而又年轻细胞的混合物随着他们的成长,从开始获得与年轻细胞率的任何偏差可能是由于使用旧的起点人口。
可重复获得足够大的人口老龄母细胞精确测量基因组不稳定性的能力是这种方法的成功至关重要。而该协议描述了使用特定的磁分选系统用于此目的,其它基团已排序酵母母细胞替代系统14,18( 见表材料 )。这样的替代系统也应该用这种方法工作,虽然可以要求厂家“协议的一些优化。无论使用哪种特定的系统中,人口规模要求依赖于突变或基因组重排所选择的学习类型的振动d不同。在最低限度,必须有足够的母细胞,以获得每群中的至少一个突变的菌落来计算的突变频率。在实践中,效果可以说是相当的变量,如果只是零到五的突变菌落从人口规模和人口规模甚至小幅增长预期,使九时五十五突变菌落预期,可以大大提高可重复性。当生物素标记的起始群体,需要为每个分类的回收效率来加以考虑,以帮助识别所必需的适当的群体大小来测量在旧母细胞的突变频率。以90%的回收率母细胞的每个排序后,只有59%的原人口将经过五轮的生长和分选回收。这降到〜33%,恢复原有的人口经过五轮的增长,如果只有80%标示母细胞进行分选回收每个排序中编。测量低频率事件时,因为在人口规模二到三倍下降易造成人口比例的突变菌落数不可靠的测量和回收最大化是至关重要的。
有许多项增加或修改本协议的有丝分裂过程中细胞衰老,获得的基因组不稳定性的更广泛的理解。简单的例子包括在分析基因的功能,媒体的变化或其它环境条件的变化改变如何改变的突变与年龄的积累。突变率对于年轻细胞具有改变的基因的功能,或在适当条件下将被测量并用于确定突变是否积聚不同于预测的速率值和不同于在对照细胞群。在不同的点复制性衰老过程中的细胞群体可以被暴露于特定的压力,如活性氧或DNA损伤剂。 á短暂轻微暴露于氧化应激并没有显着地改变,以进行细胞分选( 图3)的能力,但更严厉的应力可能复杂化细胞的恢复。初步的实验将是必要的,以验证母细胞仍然可以有效地具体讲后回收。此外,分离的母细胞的细胞特征可详细分析,包括活性氧,线粒体和液泡形态,和其他生理特性是与老化3相关联的水平。此外,母细胞可能是一个人口开始为进一步的治疗或处理。由于母亲和子细胞的过程中,在物理上是分开的,子细胞也仍然可以进行分析。例如,改变子代细胞或受损大分子的酵母母女细胞间的非对称遗传生理特性<s高达> 24不能比拟的突变频率/房价什么有趣的变化的时间。突变频率为女儿的细胞群也可以为了得到尽量模型是否存在突变的复制性衰老过程中的非对称的继承。综上所述,通过磁性细胞结合母细胞富集波动测试分选使S的优点酵母模型系统可以有效地应用于调查负责在有丝分裂细胞老化基因变化的积累机制。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是支持的,从国家研究所美国国立卫生研究院老龄化PHM被授予R00AG031911部分这篇文章的内容并不一定反映美国国立卫生研究院的官方意见。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | 100mg |
Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | 2ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1) |
MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | 25 columns suitable for QuadroMACS separator |
QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Separator Only |
QuadroMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-051 | Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15ml Tube Rack (130-091-052), One 2ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads |
BD Falcon Cell Strainer, 40 µm | BD Biosciences | 352340 | 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | Powder, filtering after dissolving important to remove particulates |
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 | Life Technologies | W11261 | Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used |
ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | 10 ml, other antifade reagents could also be used |