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Biology

फ्लो से गुर्दे उपकला कोशिकाओं में साइटोसोलिक कैल्शियम माप

Published: October 28, 2014 doi: 10.3791/51857
Automatic Translation
1, 2
1Institute for Physiology, Pathophysiology, & Toxicology, Centre for Biomedical Research and Training (ZBAF), University of Witten/Herdecke, 2Institute for Immunology & Experimental Oncology, Centre for Biomedical Research and Training (ZBAF), University of Witten/Herdecke

Summary

कैल्शियम कई शारीरिक और pathophysiological संकेत दे रास्ते में शामिल है. लाइव सेल इमेजिंग विशेष उपकरणों की आवश्यकता है और समय लग सकता है. निलंबन में लाया पक्षपाती उपकला कोशिकाओं में साइटोसोलिक कैल्शियम में रिश्तेदार परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए एक प्रवाह कोशिकामापी का उपयोग कर एक त्वरित, सरल विधि अनुकूलित किया गया था.

Introduction

कैल्शियम सेलुलर शारीरिक और pathophysiological संकेत 1 के प्रसारण के लिए जिम्मेदार एक महत्वपूर्ण दूसरा दूत है. साइटोसोलिक कैल्शियम सांद्रता कैल्शियम पंप और कैल्शियम एक्सचेंजर्स की गतिविधि के माध्यम से कम रखा जाता है. sarcoplasmic / endoplasmic जालिका कैल्शियम ATPase (SERCA) एटीपी निर्भर शिष्टाचार में दोनों, प्लाज्मा झिल्ली कैल्शियम ATPase (PMCA) कोशिकी डिब्बे में कैल्शियम extrudes जबकि एक "पंप रिसाव" प्रणाली के भाग के रूप endoplasmic जालिका (ईआर) कैल्शियम की दुकान केवल एक बार 2. ऐसे हार्मोन या न्यूरोट्रांसमीटर के रूप में शारीरिक दूतों, जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स, diacylglycerol और inositol ट्रायफ़ोस्फेट (IP3) 3 उत्पन्न करने के लिए प्लाज्मा झिल्ली में phosphatidylinositol 4,5-बाइफोस्फेट (PIP2) hydrolyses जो phospholipase सी, के सक्रियण के माध्यम से उनके संकेत संचारित. Diacylglycerol प्लाज्मा झिल्ली में रहता है, IP3 cytosol में diffuses और IP3 रिसेप्टर को बांधताईआर झिल्ली और कैल्शियम में पाया ligand कैल्शियम चैनल सक्रिय कर रहे हैं जो (IP3Rs), साइटोसोलिक कैल्शियम सांद्रता 4 में वृद्धि में बनी ईआर luminal दुकान से जारी है. Cytosol तक पहुँचने के लिए कैल्शियम के लिए एक वैकल्पिक मार्ग प्लाज्मा झिल्ली में मौजूद कैल्शियम चैनल और एक्सचेंजर्स के माध्यम से है. इन दो डिब्बों के बीच crosstalk वर्णित किया गया है: कैल्शियम प्रेरित कैल्शियम कोशिकी कैल्शियम ईआर दुकानों 5 से कैल्शियम रिहाई लाती है जहां रिलीज (CICR), और दुकान STIM से लगा है ईआर दुकानों के खाली जहां कैल्शियम प्रविष्टि (SOCE) संचालित और उरई के उद्घाटन का कारण बनता है प्लाज्मा झिल्ली में कैल्शियम चैनल ईआर भंडार 6 के refilling बढ़ावा देने के लिए.

Pathophysiological शर्तों के तहत, सेलुलर कैल्शियम प्रतिक्रिया शारीरिक stimulators 1 के अभाव में अविनियमित और साइटोसोलिक कैल्शियम बढ़ जाती है. कैल्शियम प्रतिक्रिया तरीकों की एक संख्या में प्रभावित हो सकता है: कैल्शियम लंबे समय तकसंकेत, cytosol से कैल्शियम हटाने, कैल्शियम भंडार या कैल्शियम में स्थानीय परिवर्तन की कमी देरी. इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया बफरिंग में एक केंद्रीय भूमिका पर ले और कैल्शियम 7 रिहा. लंबे समय तक और / या supramaximal साइटोसोलिक कैल्शियम वृद्धि कोशिका मृत्यु की ओर जाता है. वास्तव में, कैल्शियम अधिक बार सेलुलर pathophysiological प्रतिक्रिया में शामिल है और इस तरह मुख्य रूप से कोशिका मृत्यु के साथ जुड़े रहे हैं जो neurodegenerative रोग, हृदय रोग, कैंसर, हड्डी रोग और गुर्दे की बीमारी, जैसे रोगों की एक विस्तृत सरणी में एक महत्वपूर्ण घटना है नहीं की तुलना में है हानि या अंग या ऊतक समारोह 8-10 के परिवर्तन और. इसके अलावा, कैल्शियम संकेतों की गड़बड़ी सेलुलर अनुकूलन और सेलुलर कार्यों और प्रतिक्रियाओं में परिवर्तन से जोड़ा गया है.

परंपरागत रूप से, कैल्शियम संकेतों एक सेल पारगम्य acetoxymethyl (एएम) एस्टर रूप में कोशिकाओं में भरी हुई है कि एक नकारात्मक आरोप लगाया फ्लोरोसेंट कैल्शियम सूचक के साथ मापा जाता है. एक बार सेलुलर esteras द्वारा cleavedतों, फ्लोरोसेंट संकेतक intracellular डिब्बे के भीतर रहते हैं और कैल्शियम के लिए बाध्य है जब प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि हुई है. सबसे अच्छी तरह से जाना जाता है और इस्तेमाल किया कैल्शियम सूचक ratiometric Fura-2 रोजर Tsien और उनके सहयोगियों ने 11 से विकसित की है. कैल्शियम के लिए भिन्न समानताएं साथ कैल्शियम संकेतक अलग कैल्शियम पूल नजर रखी जा करने की अनुमति. तरीकों का पता लगाने लाइव सेल इमेजिंग, प्रतिदीप्ति microplate रीडर में शामिल हैं और प्रवाह cytometry. (आमतौर पर मिनट के लिए कुछ ही सेकंड के भीतर) कैल्शियम संकेतों के अपेक्षाकृत तेजी से कैनेटीक्स कैल्शियम संकेत की विशेषताओं के बारे में सबसे अधिक जानकारी पाने के लिए सबसे अच्छा तरीका इमेजिंग लाइव सेल बना देता है. एक तरफ (मिसे के भीतर) कैल्शियम संकेतों के तेज कैनेटीक्स से, जीना सेल इमेजिंग एक एकल कक्ष 12 के भीतर कैल्शियम संकेतन के सेलुलर compartmentalization के अध्ययन के लिए एक बेहतर तरीका है. निरपेक्ष कैल्शियम सांद्रता कैल्शियम इंडस्ट्रीज़ के न्यूनतम और अधिकतम प्रतिदीप्ति निर्धारित करने से गणना की जा सकतीGrynkiewicz एट अल. 11 द्वारा वर्णित के रूप में, क्रमशः, एक कैल्शियम chelator जोड़ने और कोशिकाओं permeabilizing द्वारा icator.

कैल्शियम संकेतों को मापने के लिए फ्लो का उपयोग पहला अवसर ऐसी झिल्ली अखंडता और सेल की आबादी की जुदाई, और एकल तरंगदैर्ध्य के विकास के साथ संयुक्त निलंबन में कोशिकाओं की आवश्यकता के रूप में कई मापदंडों को मापने के लिए जहां प्रतिरक्षा कोशिकाओं में 1980 के दशक में विकसित किया गया था कैल्शियम संकेतक एक आदर्श और convenientdetection विधि 13-15 प्रवाह cytometry बनाया. पक्षपाती कोशिकाओं में, लाइव सेल इमेजिंग कैल्शियम संकेतन, सबसे महत्वपूर्ण बात कैनेटीक्स के बारे में सबसे अधिक जानकारी प्रदान करता है, लेकिन प्राप्त करने के लिए एक तरह के तापमान के रूप में एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप, एक छिड़काव प्रणाली, सेलुलर पर्यावरण के रखरखाव, जिसमें जटिल सेटअप, और विशेष माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर की आवश्यकता और डेटा का विश्लेषण. इस तरह के एक प्रतिदीप्ति microplate रीडर या pharmacol के रूप में वैकल्पिक तरीकोंकैल्शियम chelators के उपयोग के माध्यम ogical साधन प्राप्त की जानकारी के मामले में अतुलनीय हैं. फ्लो अधिक व्यापक रूप से अध्ययन के बहुमत में है, हालांकि माप प्रदर्शन कर रहे हैं केवल अंत बिंदु पक्षपाती कोशिकाओं में साइटोसोलिक कैल्शियम की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. शुरू में गरगेली एट अल द्वारा विकसित विधि का उपयोग करना. प्रतिरक्षाविज्ञानी बी कोशिकाओं 16 में, वास्तविक समय कैनेटीक्स साथ प्रवाह cytometry और एक नमूना जनसंख्या से व्यक्ति की कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति तीव्रता निगरानी द्वारा साइटोसोलिक मुक्त कैल्शियम एकाग्रता में परिवर्तन सफलतापूर्वक कैंसर उपकला कोशिकाओं में मापा गया है और कैंसर स्टेम सेल 17 संकर. इस विधि को आगे कैल्शियम संकेतक 18 के साथ लोड करने के लिए मुश्किल हैं जो पक्षपाती उपकला कोशिकाओं में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था.

इधर, चूहा गुर्दे समीपस्थ छोटी नली (WKPT-0293 Cl.2) 19 के एस 1 खंड से ली गई एक अमर पक्षपाती उपकला सेल लाइन का उपयोग कर, हम एक अनुकूलित सरलीकृत मीटर का वर्णनफ्लो द्वारा साइटोसोलिक कैल्शियम एकाग्रता में परिवर्तन की माप के लिए ethod. कई उपकला कोशिकाओं ऋणात्मक यौगिकों के लिए जैविक ट्रांसपोर्टरों के एक नंबर के अधिकारी के बाद से, एक कैल्शियम सूचक के साथ कोशिकाओं की लोडिंग एक चुनौती साबित हो सकता है. कैल्शियम संकेतक, प्रोबेनेसिड, पेनिसिलिन 20 के गुर्दे उत्सर्जन को कम करने के लिए विकसित मूल आद्य जैविक आयनों ट्रांसपोर्टरों का अवरोध और के तपका रोकने के लिए, ऊष्मायन मध्यम में एक साथ लागू किया जाता है. कोशिकाओं, कैल्शियम सूचक लोड करने के लिए monolayers में बनाए रखा यौगिक इसके बाद तुरंत पता लगाया जा सकता निलंबन और कैल्शियम संकेतों में लाया जाता है.

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Protocol

अभिकर्मकों और समाधान के 1. तैयारी

  1. एक संशोधित हांक संतुलित नमक समाधान (HbSS) तैयार (मिमी में: 136.9 NaCl, 5.37 KCl, 0.34 ना 2 HPO 4, 0.44 के.एच. 2 पीओ 4, 4.17 3 NaHCO, पीएच 7.2, कोई फिनोल लाल). 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  2. 1.5 एम 2 CaCl और 2 एम 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) (पीएच 7.2) आसुत जल का उपयोग स्टॉक समाधान करें.
  3. प्रोबेनेसिड की एक 250 मिमी स्टॉक समाधान तैयार है. ,, 1 एन NaOH में प्रोबेनेसिड पाउडर भंग आसुत जल के साथ अंतिम मात्रा के तीन तिमाहियों के लिए भरने और धीरे धीरे 1 एन एचसीएल के साथ 7.4 पीएच को टाइट्रेट मुक्त एसिड फार्म के लिए (पानी अघुलनशील के रूप में अक्सर कहा जाता है). 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  4. 1 मिमी की एक शेयर एकाग्रता के लिए निर्जल डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में फ्लोरोसेंट झिल्ली पारगम्य कैल्शियम बाध्यकारी डाई भंग. अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  5. प्रत्येक प्रयोग करने से पहले, हौसले से तैयार प्रोबेनेसिड युक्त एचद्वारा बीएसएस प्रवाह (PHF) बफर (अंतिम सांद्रता में) 1.5 मिमी 2 CaCl, 10 मिमी HEPES, पीएच 7.2, 5% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी प्रोबेनेसिड, और 5.55 मिमी ग्लूकोज के साथ HBSS के संशोधित संयोजन. 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म.

2. सेल संस्कृति

  1. मानक संस्कृति के माध्यम में एक 6 अच्छी तरह से थाली या 35 मिमी पकवान की अच्छी तरह से प्रति प्लेट 2.5 एक्स 10 5 गुर्दे समीपस्थ छोटी नली कोशिकाओं (WKPT-0293 Cl.2) और लगभग 70% की एक confluency तक पहुँचने 2 दिनों के लिए हो जाना.

3. कैल्शियम डाई लोड हो रहा है

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से या डिश के लिए, 5% भ्रूण गोजातीय सीरम, 4 माइक्रोन सेल पारगम्य कैल्शियम बाध्यकारी डाई और 2 मिमी प्रोबेनेसिड युक्त 1 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम मिश्रण.
  2. अच्छी तरह से प्रत्येक में 1 मिलीलीटर लोडिंग डाई मिश्रण के साथ संस्कृति के माध्यम से बदलें और 5% सीओ 2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. फ्लोरोसेंट सूचक के विरंजन रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट कवर.

CE के 4. तैयारीफ्लो के लिए LLS

  1. 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म 0.05% trypsin-ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) समाधान.
  2. महाप्राण कैल्शियम लोडिंग डाई प्रत्येक अच्छी तरह से समाधान और अच्छी तरह से दीवार के साथ 1 मिलीलीटर trypsin जोड़ें.
  3. सभी कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  4. 1 मिनट के लिए 10,000 जी पर एक microcentrifuge में centrifuging द्वारा एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और गोली कोशिकाओं स्थानांतरण.
  5. ध्यान से गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate.
  6. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा 1 मिलीलीटर PHF बफर और resuspend जोड़कर कोशिकाओं को धो लें.
  7. 1 मिनट के लिए 10,000 जी पर centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं.
  8. दोहराएँ 4.6 कदम. और 4.7. एक और दो बार.
  9. 500 μl PHF बफर के अंतिम मात्रा में कोशिकाओं Resuspend और 1 घंटे के भीतर प्रयोग के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें.
  10. वैकल्पिक: गिनती कोशिकाओं सेल एकाग्रता का निर्धारण और 5 एक्स 10 4 उपयोग करने के लिए - माप प्रति 1 x 10 5 कोशिकाओं.

5. फ्लो CYTometer सेटअप

  1. , प्रवाह प्रारंभ fluidics दराज खोलने और म्यान द्रव टैंक की हवा का दबाव बढ़ाने के लिए वेंट वाल्व टॉगल स्विच फ्लिप.
  2. "प्रधानमंत्री" भीतरी ट्यूब और प्रवाह कक्ष के भीतर से संभावित रहने हवाई बुलबुले को दूर करने के साधन.
  3. फ्लो सॉफ्टवेयर में, खुले दो डॉट साजिश खिड़कियां.
    1. पहला डॉट साजिश आगे क्रमशः उनके आकार और उनके विघटन, के माध्यम से नमूना भीतर कोशिकाओं की गुणवत्ता के लिए नियंत्रित करने के लिए वाई पैरामीटर के लिए एक्स पैरामीटर और पक्ष बिखरे हुए प्रकाश (एसएससी) के लिए बिखरे हुए प्रकाश (एफएससी) की आवश्यकता है.
    2. दूसरा डॉट साजिश कैल्शियम बाध्य डाई की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापता है. एक रैखिक पैमाने पर एक्स पैरामीटर के लिए सेकंड में एक लघुगणकीय पैमाने और समय का उपयोग वाई पैरामीटर के लिए उपयुक्त प्रतिदीप्ति का पता लगाने चैनल का चयन करें.
  4. 'उच्च' के प्रवाह की दर निर्धारित करें.

6. फ्लो एमeasurement

  1. आरटी पर माप प्रदर्शन. नमूना ट्यूब (11.5 x 75 मिमी) cytometry के एक प्रवाह में, 480 μl PHF बफर जोड़ें.
  2. मिश्रण करने के लिए 20 μl सेल निलंबन और संक्षेप में भंवर जोड़ें.
  3. पक्ष को ट्यूब समर्थन हाथ ले जाएँ और एक तंग सील गठन किया है जब तक नमूना इंजेक्शन ट्यूब पर नमूना ट्यूब की स्थिति. इसकी मूल केन्द्रित स्थिति के लिए ट्यूब समर्थन बांह लौटें.
  4. नमूना का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता में लगभग 10 2 वाई अक्ष पर है कि इस तरह के प्रतिदीप्ति चैनल का समायोजन करके माप का अनुकूलन. सहेजें और बाद के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल करते हैं.
  5. एक प्रयोग शुरू करने के लिए, दोहराने 6.1-6.3 कदम.
  6. 50 सेकंड के रिकॉर्ड आधारभूत प्रतिदीप्ति.
  7. संक्षेप में जोड़ने, ब्याज, भंवर का मिश्रित नमूना ट्यूब को हटाने और नमूना इंजेक्शन ट्यूब पर लौटने, माप रोकें. यह कदम और अधिक से अधिक 15 सेकंड से नहीं लेना चाहिए.
  8. माप फिर से शुरू और 204.8 सेकंड की कुल के लिए जारी है.
  9. एक कैल्शियम मैं का उपयोगonophore, जैसे ionomycin (10 माइक्रोन), और इस तरह के इथाइलीन ग्लाइकॉल tetraacetic एसिड (EGTA) के रूप में एक कैल्शियम chelator, MnCl 2 या CoCl 2 (2 मिमी), क्रमशः सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के लिए.

7. डेटा विश्लेषण

  1. ऐसे WinMDI (फ्लो के लिए विंडोज बहु दस्तावेज़ इंटरफ़ेस), स्क्रिप्स इंस्टीट्यूट, फ्लो कोर सुविधा पर जो घूम चुके द्वारा विकसित एक मुक्त सॉफ्टवेयर पैकेज के रूप में ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए समर्पित फ्लो सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा, विश्लेषण.
  2. एसएससी और FSC मानकों के साथ एक डॉट साजिश खोलें.
  3. "क्षेत्र" उपकरण का उपयोग कर विश्लेषण के लिए कोशिकाओं का क्षेत्र चुनें मृत कोशिकाओं या डेटा विश्लेषण से नीचे बाएँ कोने में पाया सेल मलबे (चित्रा 1) को छोड़ने के लिए (छवि पर राइट क्लिक करें).
  4. चक्र विश्लेषण (चित्रा 2)
    1. वाई अक्ष पर एक्स अक्ष और प्रतिदीप्ति तीव्रता पर समय के साथ एक घनत्व साजिश खोलें. सभी घटनाओं का प्रयोग करें.
    2. हमें7.3 के रूप में ही gating के क्षेत्र ई.
    3. "चक्र" उपकरण का उपयोग करके डेटा यों.
    4. खड़ी रेखा यौगिक अलावा के समय पर रखा गया है और क्षैतिज रेखा नियंत्रण में आधारभूत प्रतिदीप्ति के केंद्र में रखा गया है कि ताकि वृत्त का चतुर्थ भाग विभाजक समायोजित करें. वृत्त का चतुर्थ भाग विभाजक की स्थिति सभी नमूनों में समान है कि सुनिश्चित करें.
    5. प्रत्येक चक्र में कोशिकाओं का प्रतिशत प्रत्येक कोने (चित्रा 2) में प्रदर्शित किया जाता है. नमूने के बीच ऊपरी सही चक्र (उर) की तुलना करें.
  5. हिस्टोग्राम विश्लेषण (चित्रा 3)
    1. वाई अक्ष पर एक्स अक्ष और घटनाओं पर प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ एक हिस्टोग्राम खिड़की में नियंत्रण डेटा खोलें. सभी घटनाओं का प्रयोग करें.
    2. एक सचित्र अवलोकन के लिए, ओवरले भूखंडों के रूप में नियंत्रण साजिश (चयन फ़ाइल → ओवरले → ओपन फाइल → फाइल करने के लिए जाना) की तुलना में किया जा करने के लिए परीक्षण के आंकड़ों को जोड़ने.
    3. मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, एक हिस्टोग्राम जीतDows इस्तेमाल किया जाना चाहिए. गेट कदम 7.3 से क्षेत्र आर 1 का उपयोग सेल की आबादी.
    4. गैर इलाज नियंत्रण में, अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता में न्यूनतम और नियंत्रण शिखर की अधिकतम प्रतिदीप्ति और समाप्त होने के बीच मध्य से शुरू विश्लेषण के लिए क्षेत्र चिह्नित करने के लिए ("मार्करों") मार्कर समारोह का उपयोग करें. इस क्षेत्र में कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना है.
    5. सांख्यिकी विंडो से डेटा निकालते हैं. विश्लेषण के लिए एक ही चिह्नित क्षेत्र का उपयोग कर डेटा फ़ाइलों शेष के लिए दोहराएँ.
  6. प्रतिदीप्ति तीव्रता विश्लेषण (चित्रा 4)
    1. वाई अक्ष पर एक्स अक्ष और प्रतिदीप्ति तीव्रता पर समय के साथ एक डॉट साजिश खोलें. सभी घटनाओं का प्रयोग करें.
    2. "कैनेटीक्स मोड" और "ओवरले कैनेटीक्स रेखा" सक्षम. एक नीली रेखा मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व डॉट साजिश में दिखाई देगा.
    3. कई आयताकार क्षेत्रों बनाने के द्वारा सापेक्ष कैल्शियम बाढ़ यों. प्रत्येक क्षेत्र ओ होनी चाहिए"10 सेकंड" के बराबर है जो "50", के बारे में की idth. 15 आयताकार क्षेत्रों को परिभाषित.
    4. सांख्यिकी विंडो से मात्रा का ठहराव निकालते हैं और एक स्प्रेडशीट में कॉपी.
    5. विश्लेषण के लिए वाई मतलब डेटा का उपयोग करें. 20 सेकंड से 50 के बराबर है जो R6, को R2 का मतलब गणना. यह आधारभूत मूल्य है.
    6. कैल्शियम बाढ़ विश्लेषण (शुरुआत, अवधि और तीव्रता पर निर्भर करता है) के लिए एक उपयुक्त समय अंतराल चुनें.
    7. मतलब आधारभूत मूल्य इस समय अंतराल रिश्तेदार के भीतर 100% पर सेट है जो परिसर के अलावा, इससे पहले कि है, प्रतिदीप्ति संकेत प्रत्येक क्षेत्र से कैल्शियम संकेतों की गणना. यौगिक अलावा पोस्ट मतलब और क्षेत्रों के मानक विचलन का निर्धारण करते हैं; इस परिसर के द्वारा पैदा मतलब कैल्शियम संकेत है.

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Representative Results

साइटोसोलिक कैल्शियम बढ़ाने के लिए, दो औषधीय यौगिकों सेल पारगम्य कैल्शियम बाध्यकारी डाई, fluo-3-बजे से भरी हुई गुर्दे समीपस्थ छोटी नली कोशिकाओं (WKPT-0293 Cl.2) को लागू किया गया. Nontreated नियंत्रण नमूने प्रोबेनेसिड की उपस्थिति में कैल्शियम बाध्यकारी डाई के साथ भरी हुई थी और मिश्रित लेकिन किसी भी यौगिकों के अलावा बिना किया गया. Thapsigargin (टीजी) ईआर के बाहर रिसाव के प्रमुख और बढ़ साइटोसोलिक कैल्शियम में जिसके परिणामस्वरूप SERCA पंप की एक शास्त्रीय अवरोध करनेवाला है. Tunicamycin (TUN) ब्लॉक सामने आया प्रोटीन प्रतिक्रिया के सक्रियण के लिए अग्रणी प्रोटीन के एन ग्लाइकोसिलेशन लेकिन यह भी साइटोसोलिक कैल्शियम 18,21 बढ़ जाती है. एक सकारात्मक नियंत्रण, ionomycin (IONO) के रूप में, कोशिकी कैल्शियम के लिए प्लाज्मा झिल्ली पारगम्य बनाने कैल्शियम ionophore, इस्तेमाल किया गया था. विश्लेषण के लिए, सेल आबादी (चित्रा 1 में आर 1) एसएससी / FSC डॉट साजिश में एक क्षेत्र का चयन करके gated गया था. समय बनाम प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए एक घनत्व भूखंड प्रत्येक डेटा फ़ाइल के लिए बनाया गया था. वृत्त का चतुर्थ भाग समारोह का उपयोग करके, डॉट साजिश आधारभूत प्रतिदीप्ति से पहले और यौगिक इसके बाद और ऊपर और नीचे Fluo-3 प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व चार क्षेत्रों में विभाजित किया गया था. प्रत्येक चक्र में gated सेल जनसंख्या के प्रतिशत के रूप में मात्रा में वृद्धि हुई साइटोसोलिक कैल्शियम एकाग्रता का निर्धारण करने की अनुमति देता है. इस उदाहरण में, 3 माइक्रोन टीजी एक कैल्शियम संकेत प्रेरित किया गया है यह दर्शाता है कि ऊपरी सही चक्र में कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि का कारण बनता है. कोशिकाओं का प्रतिशत टीजी इलाज कोशिकाओं में 51.3% (1.20 गुना) को नियंत्रण में 42.8% से बढ़ जाती है. इसी प्रकार 6 माइक्रोन TUN 49.9% (1.17 गुना) की वृद्धि हुई कैल्शियम प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ कोशिकाओं के प्रतिशत augments. 10 माइक्रोन IONO के आवेदन ऊपरी सही चक्र में कोशिकाओं (चित्रा 2) के 65.5% (1.53 गुना) में हुई. हिस्टोग्राम विश्लेषण 1.41 गुना, 1.36 गुना और टीजी, TUN और IONO, क्रमशः (चित्रा 3) से 2.11 गुना के परिणामस्वरूप (सांख्यिकी के लिए, देख <समर्थन> 18). अंत में, कई क्षेत्र विश्लेषण मोड का उपयोग, टीजी, TUN और IONO 1.55 गुना, 1.29 गुना और नियंत्रण, क्रमशः (चित्रा 4) से अधिक कैल्शियम संकेत में 4.54 गुना वृद्धि हुई.

सबसे संवेदनशील विश्लेषण मोड कई क्षेत्र विश्लेषण था. सेल की आबादी का वितरण मात्रा निर्धारित है जहां वृत्त का चतुर्थ भाग और हिस्टोग्राम विश्लेषण मोड, के विपरीत, कई क्षेत्र विश्लेषण मोड कुल सेल की आबादी से फ्लोरोसेंट संकेत में परिवर्तन quantifies. अलग विश्लेषण मोड से परिणामों में सबसे बड़ी विसंगति कई क्षेत्र विश्लेषण से 4.54 गुना वृत्त का चतुर्थ भाग के विश्लेषण से नियंत्रण खत्म 1.53 गुना वृद्धि से लेकर कि ionomycin के लिए था. जांच की यौगिकों ऐसे विचरण प्रदर्शन नहीं किया. निरपेक्ष मूल्यों मतभेद हालांकि, हालांकि सभी विश्लेषण मोड के दौरान, कैल्शियम सिग्नल की हद तक यानी, एक ही बनी हुई, IONO TUN टीजी द्वारा और फिर इसके बाद सबसे बड़ा प्रभाव था. टीजी, TUN या IONO के आवेदन साइटोसोलिक कैल्शियम में स्थायी बदलाव में परिणाम है. क्षणिक हैं जो शारीरिक कैल्शियम का संकेत है,, इस पद्धति का उपयोग करके मापा जा सकता है कि यह निर्धारित करने के लिए, एटीपी WKPT-0293 Cl.2 कोशिकाओं को लागू किया गया था. एटीपी विधि प्रवाह cytometry द्वारा अपनी संपूर्णता में दर्ज नहीं किया जा सकता है जो एक तेजी से और क्षणिक कैल्शियम संकेत, पैदा की. 20 में एटीपी सांद्रता - 100 माइक्रोन एकाग्रता कैल्शियम संकेतों "धीमा" करने के लिए कम हो गया था इसलिए पता लगाने के लिए मुश्किल थे. चित्रा 5 में दिखाया गया है, साइटोसोलिक कैल्शियम में बदलाव 5 माइक्रोन एटीपी के अलावा के बाद मापा जा सकता है. फिर भी, प्रतिदीप्ति परिवर्तन के शिखर दर्ज नहीं किया गया था. वृत्त का चतुर्थ भाग विश्लेषण (चित्रा 5 ब) और हिस्टोग्राम विश्लेषण का प्रयोग (चित्रा 5C) मोड, एटीपी में कैल्शियम संकेतों में कोई अंतर नहीं होने के कारण कैल्शियम संकेत के क्षणिक प्रकृति को पता लगाया जा सकता है. हालांकि, ट्रेस के चयनित भागों के साथ, कई rectangulaअनुसंधान क्षेत्र विश्लेषण मोड तुरंत बाद माप (चित्रा 5A) फिर से शुरू कैल्शियम संकेत में एक 1.85 गुना वृद्धि दर्ज की गई.

चित्रा 1
चित्रा 1. एसएससी FSC डॉट साजिश बनाम. सेल की आबादी की अखंडता ओर तितर बितर (एसएससी) और आगे तितर बितर (FSC) का उपयोग कर मूल्यांकन किया है. एक क्षेत्र आगे के विश्लेषण के लिए (आर 1) चुना गया है. प्रकाश बिखरने को कम कर दिया जो मृत कोशिकाओं और सेल मलबे, बाहर रखा गया है. एक प्रतिनिधि डॉट प्लाट दिखाया गया है.

चित्रा 2
चित्रा 2. चक्र विश्लेषण. डाई लोड WKPT-0293 Cl.2 कोशिकाओं बंधन कैल्शियम की आधारभूत प्रतिदीप्ति 50 सेकंड के लिए मापा गया था. मापन बंद कर दिया गया था, यौगिक या डिluent जोड़ा गया है, मिश्रण करने के लिए vortexed और माप 204.8 सेकंड की कुल के लिए तुरंत फिर से शुरू किया गया था. मात्रा वृत्त का चतुर्थ भाग विश्लेषण का उपयोग किया गया था. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. हिस्टोग्राम विश्लेषण. टीजी, TUN या IONO के साथ इलाज डाई लोड WKPT-0293 Cl.2 कोशिकाओं बंधन कैल्शियम की हिस्टोग्राम साजिश है. मार्कर समारोह, नियंत्रण वक्र के शिखर पर मार्कर का शुरुआती बिंदु स्थिति और अधिकतम प्रतिदीप्ति में समाप्त होने से मात्रा निर्धारित किया गया था उच्च कैल्शियम बाध्यकारी डाई प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ gated कोशिकाओं के प्रतिशत का उपयोग करना. एक larg देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के एर संस्करण.

चित्रा 4
4. कई क्षेत्र विश्लेषण चित्रा. डाई लोड WKPT-0293 Cl.2 कोशिकाओं बंधन कैल्शियम की आधारभूत प्रतिदीप्ति 50 सेकंड के लिए मापा गया था. मापन, यौगिक या मंदक जोड़ा गया है, बंद कर दिया मिश्रण करने के लिए vortexed और माप 204.8 सेकंड की कुल के लिए तुरंत फिर से शुरू किया गया था. मात्रा कई आयताकार क्षेत्र विश्लेषण का उपयोग किया गया था. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
एटीपी प्रेरित कैल्शियम संकेतों के चित्रा 5. विश्लेषण. आधारभूत प्रतिदीप्ति ओडाई लोड WKPT-0293 Cl.2 कोशिकाओं बंधन एफ कैल्शियम 50 सेकंड के लिए मापा गया था. मापन, 5 माइक्रोन एटीपी जोड़ा गया है, बंद कर दिया मिश्रण करने के लिए vortexed और माप 204.8 सेकंड की कुल के लिए तुरंत फिर से शुरू किया गया था. डेटा एकाधिक आयताकार क्षेत्र विश्लेषण (ए), वृत्त का चतुर्थ भाग विश्लेषण (बी) या हिस्टोग्राम विश्लेषण (सी) का उपयोग मात्रा गया था. कई क्षेत्र विश्लेषण के लिए, केवल क्षणिक कैल्शियम संकेत विश्लेषण किया गया था. प्रतिनिधि डेटा या एन से विश्लेषण = 3 -. 7 दिखाए जाते हैं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

कैल्शियम एक दूसरे के दूत संकेत अणु के रूप में और भी ईआर और माइटोकॉन्ड्रिया के बीच संवाद करने के लिए एक साधन के रूप में कार्य कई सेलुलर प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण घटना है. मुक्त साइटोसोलिक कैल्शियम की सांद्रता में परिवर्तन को मापने की क्षमता कोशिका जीव विज्ञान के सभी क्षेत्रों के लिए लागू कर सकते हैं कि एक उपयोगी तकनीक है. साइटोसोलिक कैल्शियम संकेतों का पता लगाने के लिए विभिन्न तरीके हैं. प्रतिष्ठित, ऐसे Fura-2 के रूप में एक ratiometric कैल्शियम सूचक, से संकेत, एक प्रतिदीप्ति इमेजिंग सेटअप और निरपेक्ष कैल्शियम की सांद्रता का उपयोग जीवित कोशिकाओं में निगरानी कर रहे हैं न्यूनतम और अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण करने से प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि, इस तकनीक के इस तरह के एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप, सेट अप एक लाइव सेल इमेजिंग और विश्लेषण सॉफ्टवेयर के रूप में, विशेष उपकरणों की आवश्यकता है. यहाँ, हम सबसे प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ है जो प्रवाह cytometry का उपयोग पक्षपाती उपकला कोशिकाओं के cytosol में कैल्शियम का पता लगाने के लिए एक सरल विधि का वर्णन.

Epithelia पुलिस में हैंचयापचयों, xenobiotics और दवाओं के परिवहन के लिए जिम्मेदार ट्रांसपोर्टरों की एक सरणी के ssession. विशेष महत्व की जो जैविक कटियन और जैविक आयनों ट्रांसपोर्टरों 22 सदस्य बनने के लिए, और SLC22A superfamily है, अपने सदस्यों से 23 के बीच बहुऔषध प्रतिरोध पी-ग्लाइकोप्रोटीन ABCB1 और बहुऔषध प्रतिरोध प्रोटीन (MRPs) में गिना जाता है जो एटीपी बाध्यकारी कैसेट (एटीपी) superfamily, . गरगेली एट अल द्वारा पत्र में वर्णित के रूप में चूहा गुर्दे समीपस्थ छोटी नली सेल लाइन WKPT-0293 Cl.2 का उपयोग प्रारंभिक प्रयोगों प्रदर्शन किया गया. 16. कोशिकाओं निलंबन में लाया और Fluo-3 AM के साथ भरी हुई थी. हालांकि, केवल एक मामूली परिवर्तन 10 माइक्रोन ionomycin (वृत्त का चतुर्थ भाग के विश्लेषण से नियंत्रण में 50.95% या एकाधिक क्षेत्र विश्लेषण से 1.78 गुना बनाम 38.14%) के साथ मनाया गया. हम उपकला ट्रांसपोर्टरों Fluo -3 AM के साथ कोशिकाओं के गरीब लोड करने के लिए जिम्मेदार थे धारणा है कि. इस समस्या, प्रोबेनेसिड और PSC833, कार्बनिक एक के अवरोधकों को नाकाम करने के लिएNion ट्रांसपोर्टरों और बहुऔषध प्रतिरोध पी-ग्लाइकोप्रोटीन, क्रमशः, कैल्शियम सेल monolayers को डाई बंधन के साथ एक साथ लागू किया गया. PSC833 चीनी हम्सटर अंडाशय कोशिकाओं 24 में पिछले एक रिपोर्ट के विपरीत है जिसमें कोई प्रभाव नहीं पड़ा है, जबकि आधारभूत प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि के संकेत के रूप प्रोबेनेसिड, डाई लोड हो रहा बाध्यकारी कैल्शियम सुधार हुआ. यह अंतर शायद अलग सेल लाइनों में ABCB1 के स्तर में निहित है; WKPT-0293 Cl.2 सेल लाइन इस तरह विषाक्त धातुओं 25,26 के रूप में विषाक्त पदार्थों, द्वारा प्रेरित किया जा सकता है जो ABCB1 की एक कम अंतर्जात स्तर, बंदरगाहों. कैल्शियम डाई लोड हो रहा है सुधार करने के लिए प्रोबेनेसिड के उपयोग जैसे कैल्शियम संकेतन intracellular संकेतन में एक भूमिका निभा सकते हैं जहां तंत्रिका तंत्र, रक्त मस्तिष्क बाधा और जिगर की कोशिकाओं के रूप में प्रोबेनेसिड के प्रति संवेदनशील परिवहन प्रणालियों का प्रदर्शन करने वाले अन्य प्रकार की कोशिकाओं, के लिए बढ़ाया जा सकता है रास्ते.

कैल्शियम की आसान पता लगाने के अपने requi में Fluo-3 झूठ के लिए बाध्यकेवल एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (506 एनएम) और एक उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य (525 एनएम) के rement. हालांकि, एकल तरंगदैर्ध्य कैल्शियम एक गैर ratiometric डाई रूप, रंग बंधन के साथ उत्पन्न डेटा, केवल गैर इलाज नियंत्रण खत्म साइटोसोलिक कैल्शियम में रिश्तेदार बढ़ जाती है यों इस्तेमाल किया जा सकता है. एक वर्णक्रमीय पारी कि असमान डाई लोड हो रहा है और विरंजन के सुधार के लिए अनुमति देता है बंधन कैल्शियम के बाद होता है, क्योंकि संपूर्ण कैल्शियम की सांद्रता निर्धारित करने के लिए, एक ratiometric डाई आवश्यक है. ratiometric डाई भारत-1 27,28 प्रवाह cytometry द्वारा प्रतिरक्षा कोशिकाओं में कैल्शियम लामबंदी का पता लगाने में इस्तेमाल किया गया है लेकिन अब तक, इस उपकला कोशिकाओं में प्रदर्शन नहीं किया गया है. (कैल्शियम बाध्य जब और 475 एनएम कैल्शियम मुक्त जब 400 एनएम) Grynkiewicz एट अल. 11 द्वारा वर्णित के रूप में, पूर्ण साइटोसोलिक कैल्शियम की सांद्रता निर्धारित किया जा सकता यूवी उत्तेजनीय भारत-1 के दो उत्सर्जन स्पेक्ट्रा का उपयोग करना.

हमारे उदाहरण डेटा एपी प्रेरित कि औषधीय यौगिकों कार्यरतसाइटोसोलिक कैल्शियम में ermanent परिवर्तन. शारीरिक कैल्शियम का संकेत है, कम तीव्रता के होते हैं तेज कैनेटीक्स प्रदर्शन और क्षणिक हैं, इस प्रकार प्रश्न विधि प्रवाह cytometry शारीरिक कैल्शियम संकेतों का पता लगाने के लिए काफी संवेदनशील है के रूप में बनी हुई है. एटीपी के साथ प्रयोग (लाइव सेल इमेजिंग द्वारा मापा) एटीपी के आवेदन पर वृद्धि हुई कैल्शियम संकेत द्वारा प्रदर्शन के रूप में purinergic रिसेप्टर्स बंदरगाहों जो WKPT-0293 Cl.2 सेल लाइन, के साथ प्रदर्शन किया गया. 100 माइक्रोन एटीपी, लेकिन परिसर के अलावा संकेत के केवल एक हिस्से को दर्ज किया जा सकता है मतलब है कि बाद माप शुरू करने में देरी के साथ संयुक्त संकेत के तेजी से प्रकृति - कोशिकामापी, बढ़ साइटोसोलिक कैल्शियम 1 के साथ मनाया जा सकता है प्रवाह का उपयोग करना. इस प्रकार विधि प्रवाह cytometry का एक बड़ा नुकसान अपनी तेजी (<10 सेकंड) दर्ज करने के लिए सीमित क्षमता और क्षणिक कैल्शियम संकेत है; बल्कि विधि धीमी क्षणिक संकेतों (> 10 सेकंड) या लगातार ऊंचा Calc को जन्म दे कि उत्तेजनाओं के लिए अधिक उपयुक्त हैIUM का संकेत है. इन सीमाओं उत्तेजक एकाग्रता कम करने से या cytosol में जारी कैल्शियम बनाए रखने के लिए कैल्शियम अवरोध तंत्र के लिए अवरोधकों को लागू करने लेकिन सावधानी साइटोसोलिक कैल्शियम प्रतिशत से वृद्धि नहीं करता है कि एक अवरोध करनेवाला एकाग्रता का चयन करने के लिए लिया जाना चाहिए द्वारा धोखा दिया जा सकता है.

जानकारी लाइव सेल इमेजिंग द्वारा अधिग्रहीत और फ्लो काफी अलग हैं. लाइव सेल इमेजिंग के साथ, उच्च संकल्प कैल्शियम में स्थानिक परिवर्तन इमेजिंग के लिए एकल कक्षों के intracellular क्षेत्रों का चयन करके मापा जा सकता है कि इसका मतलब है. इसलिए तेजी से कैल्शियम संकेतों दर्ज किया जा सकता 2 सेकंड - इसके अलावा, प्रतिदीप्ति संकेत लगातार हर 1 अर्जित कर रहे हैं. इसके विपरीत cytometry, धीमी और लंबे समय तक चलने कैल्शियम संकेतों के लिए अधिक अनुकूल है, और एक पूरे सेल जनसंख्या से कैल्शियम संकेतों के उपाय प्रवाह. कैल्शियम संकेतों में ही रिश्तेदार परिवर्तन विधि प्रवाह cytometry साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. लेकिन, विधि प्रवाह cytometry लाभ के एक नंबर हैपारंपरिक लाइव सेल इमेजिंग से अधिक tages: यौगिकों (stimulators और कैल्शियम संकेतन के अवरोधकों की 1) उच्च throughput प्रदर्शन) किया जा सकता है; 2) विशिष्ट इमेजिंग विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है; 3) अनुसंधान तकनीशियनों माप प्रदर्शन कर सकते हैं; 4) मतलब नहीं है कि नैदानिक ​​और गैर चिकित्सीय प्रयोगशालाओं कैल्शियम संकेतन की जांच कर सकते हैं उच्च संकल्प इमेजिंग और ratiometric कैल्शियम माप प्रदर्शन करने के लिए. साथ में ले ली, विधि प्रवाह cytometry, कैनेटीक्स अन्वेषक शुरू में कैल्शियम के लिए एक भूमिका स्थापित करना चाहती है और आसानी से नदी के ऊपर और नीचे की ओर संकेत दे रास्ते निर्धारित करने के लिए अवरोधकों लागू हो सकते हैं अगर जीना सेल इमेजिंग (कैल्शियम संकेत चिह्नित करने की आवश्यकता होगी, जबकि उपयोगी है जैसे. आगे विस्तार में, तीव्रता, स्थानिक परिवर्तन).

संक्षेप में, हम में साइटोसोलिक कैल्शियम में वास्तविक समय सापेक्ष परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक त्वरित, सरल और संवेदनशील विधि का वर्णन मुश्किल-लोड पक्षपाती उपकला गुर्दानिलंबन में लाया गया है जो कोशिकाओं,. Cytometry के एक प्रवाह के लिए उपयोग के बिना प्रयोगकर्ताओं के लिए, इस विधि को आसानी से एक क्युवेट में सेल निलंबन के साथ एक spectrofluorimeter के लिए लागू किया जा सकता है.

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Acknowledgments

प्रयोगशालाओं में रिसर्च फ्रिट्ज-शराबी फाउंडेशन, म्यूनिख, जर्मनी (टीडी) और (डब्ल्यू-के.एल. करने के लिए) Witten / Herdecke आंतरिक अनुसंधान अनुदान के एक विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित है. हम उपयोगी सुझाव के लिए (फिजियोलॉजी, pathophysiology एवं विष विज्ञान, Witten विश्वविद्यालय / Herdecke के लिए संस्थान) प्रोफेसर डा डा फ्रैंक Thévenod धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluo-3, AM Invitrogen F-1241  Cell permeable
Probenecid Sigma-Aldrich P-8761 Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-062
Ionomycin Sigma-Aldrich I9657
Thapsigargin Tocris Bioscience 1138
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765
FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) Joe Trotter, The Scripps Institute Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.
WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case
Western Reserve University, Cleveland, OH)

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 92 गुर्दा FACS दूसरा दूत समीपस्थ छोटी नली कैल्शियम संकेतक प्रोबेनेसिड endoplasmic जालिका ionomycin
फ्लो से गुर्दे उपकला कोशिकाओं में साइटोसोलिक कैल्शियम माप
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Lee, W. K., Dittmar, T. Cytosolic… More

Lee, W. K., Dittmar, T. Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (92), e51857, doi:10.3791/51857 (2014).

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