Abstract
Telomerase, en ribonucleoprotein, er ansvarlig for vedligeholdelse af telomer længde og dermed fremme genomisk integritet, proliferation og levetid. Telomerase beskytter mitokondrier mod oxidativ stress og bibringer resistens over for apoptose, hvilket tyder på dens mulige betydning for overlevende ikke-mitotiske, meget aktive celler, såsom neuroner. Vi har tidligere demonstreret evne af nye telomerase aktivatorer til at øge telomeraseaktivitet og ekspression i de forskellige muse områder af hjernen og beskytte motorneuroner celler fra oxidativ stress. Disse resultater styrker forestillingen om, at telomerase er involveret i beskyttelsen af neuroner fra forskellige læsioner. For at understrege betydningen af telomerase i hjernen, vi her sammenligne aktiviteten af telomerase i mandlige og kvindelige mus hjerne og dens afhængighed af alder. TRAP-analysen er en standardmetode til påvisning af telomerase-aktivitet i forskellige væv eller cellelinier. Her vise vi analysis af telomerase-aktivitet i tre regioner i musehjerne ved ikke-denaturerende proteinekstraktion hjælp CHAPS lyseringsbuffer efterfulgt af modifikation af standard TRAP-assay.
I dette 2-trins assay endogen telomerase elongates en specifik telomerase-substrat (TS primer) ved tilsætning TTAGGG 6 bp gentagelser (telomerase-reaktion). Telomerase reaktionsprodukter amplificeret ved PCR-reaktionen at skabe en DNA-stige af trin 6 bp. Analysen af DNA-stige er lavet af 4,5% høj opløsning agarosegelelektroforese efterfulgt af farvning med meget følsomme nucleinsyrefarve.
Sammenlignet med den traditionelle TRAP-assay, der anvender 32P-mærket radioaktivt dCTP er til DNA-detektion og polyacrylamidgelelektroforese for at løse DNA-stige, denne protokol giver en ikke-toksisk tidsbesparende TRAP-assay til evaluering af telomerase-aktivitet i muse hjerne, hvilket viser evnen til at detektere forskelle i telomerase-aktivitet i de forskellige kvindelige og mandlige mus hjerne region.
Introduction
Telomerase er et ribonukleoprotein sammensat af telomerase-revers transkriptase (TERT), den katalytiske subunit af telomerase, og en RNA-bestanddel (tert). Den kanoniske rolle telomerase er at bevare den korrekte længde af telomerer ved tilsætning af repetitive sekvenser (TTAGGG) til telomer ender derfor fremme genomisk integritet og celleproliferation 1. Yderligere roller blev tilskrevet TERT i celler, dvs det giver resistens over for apoptose induceret af forskellige ødelæggende middel 2, beskytter humane mesenkymale stamceller fra oxidativt stress 3, og spiller en pro-overlevelse rolle i fuldt differentierede neuroner ved sin forening til TIA1 positiv RNA granulat 4.
TERT udtrykkes og aktiv primært i somatiske dividere celler og i de fleste typer af kræft, mens enzymekspression og aktivitetsniveau er stramt reguleret i ikke-delende celler 5,6. Undersøgelser har vist, at i ROdent hjerne bliver påvises ved postnatal dag 10 telomeraseaktivitet, mens TERT-mRNA holdes på et lavere niveau i voksenalderen 7. Andre studier har vist telomerase aktivitet i voksen sub-ventrikulær zone, lugtekolben, hippocampus, og i den voksne lillehjernen og cortex 8. Vi har for nylig påvist, at hidtil ukendte forbindelser, der øger telomerase-ekspression og aktivitet i hjernen og rygmarven, som udøves neurobeskyttende virkninger i N-methyl-D-aspartat (NMDA) - injicerede mus, forsinket indtræden og progression af amyotrofisk lateral sklerose i SOD1 transgene mus og øget overlevelsen af motoriske neuroner i rygmarven af disse mus 9. For helt at forstå pro-overlevelse rolle telomerase i neuroner og i hjernen, er det vigtigt at udvikle en enkel og relativt følsom hurtig analyse til påvisning af telomerase-aktivitet i de forskellige områder af hjernen.
Den telomerisk rEPEAT amplifikationsprotokol (TRAP) er et velkendt følsom analyse kombinere kanoniske aktivitet af telomerase og polymerasekædereaktionen (PCR). I dette assay telomerase tilføjer TTAGGG gentager til en telomerase-substrat (TS primer) oligonukleotid, efterfulgt af PCR-amplifikation, som genererer seks basepar (bp) DNA-stige hjælp TS reverse primer -. ACX 32P-mærket dCTP s anvendes til at detektere lav mængde af PCR-produkter. DNA stigen er løst ved sekventering polyacrylamidgelelektroforese (PAGE). Både intensiteten af DNA-båndene og længden af DNA-stigen afspejler mængden af aktivt enzym-molekyler og deres processivitet henholdsvis 10.
Denne traditionelle analyse besidder nogle store problemer: Faren for at blive udsat for radioaktive stoffer, store og svært at håndtere sekventering siden og tidsforbrug af gelen kørende og film eksponering af det radioaktive produkt (natten over i begge tilfælde). Denne protokol giver en forbedret ikke-radioaktive agarose mini-gel-baseret assay. DNA 6 bp stigen er løst ved hjælp af 4,5% høj opløsning agarosegel, og påvisning opnås ved anvendelse af meget følsomme nucleinsyrefarve. Kombinationen af ved hjælp af højtopløsende agarose mini-gel og følsom nucleinsyrefarve nem at håndtere assay eliminerer faren for udsættelse for radioaktivitet, og forkorte den samlede analyse varighed fra 3 dage til adskillige timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg blev godkendt af den etiske komité for dyreforsøg i Ben-Gurion-universitetet (IL-39-08-2010).
1. Mus Brain proteinekstraktion
- Forbered 3 rør med 15 ml hver indeholder 5 ml Ringers opløsning og placere rørene på is.
- Sacrifice musen ved at bruge Isofluran anæstesi (ADVARSEL - brug kemisk hætte) i 10-20 sekunder efterfulgt af cervikal dislokation og øjeblikkelig halshugning.
- Fjern hjerne fra kraniet og skyl i nogle få sekunder med iskold Ringers opløsning for at forhindre skade på hjernevæv.
- Ved hjælp af en kirurgisk kniv, adskille lillehjernen (CR) og hjernestammen (BS) fra den frontale cortex. Dernæst adskille lillehjernen fra hjernestammen og skære frontallappen (FL) fra den frontale cortex; fjerne lugtekolben fra frontallappen. Placer de 3 områder af hjernen i de udpegede 15 ml rør.
- Homogeniseres vævet i hvert rør. Tilføj frESH iskold Ringers opløsning, så hvert rør indeholder samme volumen og centrifugeres i 7 min ved 800 x g.
- Supernatanten fjernes, og der tilsættes 100 ul CHAPS lysepuffer til hvert rør. Bland godt, ved at føre flere gange opløsning (~ 10) gennem en 1 ml sprøjte med en 21 G nål og inkuber på is i 30 minutter.
- Overfør indholdet af hvert rør til en ny mikro-centrifugerør og centrifugeres i 30 minutter ved 13.000 x g. Supernatanten overføres til et nyt mikro-centrifugerør og bestemme proteinkoncentrationen ved hjælp af en tidligere etableret metode. Opbevar proteinekstrakter i portioner af 10 pi ved -80 ° C.
2. TRAP Assay Udarbejdelse af Instrumenter, reaktionsopløsninger og protein Fortynding Beregninger
- Forbered passende antal mærkede mikrocentrifugerør til proteinekstrakt fortyndinger og telomerase Reaktionsbufferen. Udfør alt pipettering i protokollen ved hjælp af filter tips til at forhindre forurening. Optø følgende løsninger på is: TRAP reaktion mix 10x, TS-primer, dNTP'er, UPW og proteinekstrakter (se tabel af materialer til og reagenser koncentrationer).
- Løsning af proteinekstrakten fortyndes til en slutkoncentration på 1 pg / pl hjælp ultrarent vand (UPW).
3. Telomerase Reaktion
- Forbered telomerase reaktionsblanding ved at tilføje følgende til en mikro-centrifugeglas: 2 pi TRAP mix (10x), 1 gl TS primer (0,1 ug), 1 gl dNTP'er (10 mM) og 15 ul ultrarent vand. For flere prøver, formere ovennævnte mængder med antallet af prøver, plus 1.
- Tilføj 19 ul af reaktionsblandingen i hvert reaktionsglas og tilsættes 1 ml af den fortyndede proteinekstrakt (1 ug protein) til hvert rør i et slutvolumen på 20 ul.
- Placer reaktionsrørene i et 30 ° C forvarmet vandbad i 45 minutter.
4. PCR-reaktion
- Femten min inden udgangen af telomerase reaktion, optø følgende løsninger: ACX primer, Titanium Taq Buffer, UPW.
- Forbered PCR mix ved at tilføje følgende til en mikro-centrifugeglas: 2,5 ul Titanium Taq Buffer (10x), 1 gl ACX primer (0,1 ug), 2 pi UPW (1 pi når IC bruges) og 0,5 pi Titanium Taq-polymerase (50x). For flere prøver, formere ovennævnte mængder med antallet af prøver plus 2.
- Tilsæt 6 pi af PCR-blanding til hvert PCR-rør og tilsæt hele mængden af telomerase-reaktion (20 ul) til hvert rør i et slutvolumen på 26 ul.
- Sæt PCR-rør til en PCR termo variator og køre følgende program:
- 90 ° C - 2 min.
- 94 ° C -. 30 sek *
- 60 ° C -. 30 sek *
- 72 ° C -. 45 sek *
- 72 ° C - 2 min.
Store PCR-produkter ved -20 ° C.
* = 34 cykler
5. Agarose Mini-gel Forberedelse, Prøver Løb, og gelfarvning
- 25 ml afkølet elektroforese buffer (TBE) og en omrørerstav i et bægerglas, der er 2-4 gange volumenet af bufferopløsningen og langsomt drys 1.125 g af høj opløsning (HR) agarosepulver medens opløsningen hurtigt omrøres . Fjern omrører, tildækkes med en plastfolie og gennembore i et lille hul til ventilation. Varm bægeret i mikrobølgeovnen på "Low" magt i 3 min og derefter skifte til "Høj" magt og opløsningen opvarmes i korte pulser med omhu for ikke at forårsage spilde. Bemærk, at når skummet skabt ved opvarmning bliver store bobler og forsvinder efter et par sekunder, agarose er klar.
- Cast gelen til en vandret apparat mini-gel, efter at gelen størkner ved stuetemperatur tillade gelen til nedkøling i 20 minutter ved 4 ° C før brug.
- Load hver bane med 25 ul TRAP prøve (20 ul TRAP PCR-produkter og 5 pi 6x gel-loading dye) og køre ved 110 V i 3 timer i et 4 ° C koldt rum.
- Forbered nucleinsyrefarve 3x arbejder ved tilsætning af 15 gl 10.000X nukleinsyre-syre pletten, stamopløsning til 50 ml dobbelt destilleret vand (DDW) med 0,1 M NaCl (0,29 g). Farv gelen i 20 minutter med forsigtig rystning.
- Brug UV-transilluminator med 302 nm bølgelængde for at se TRAP stigen DNA-bånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele celle proteinekstrakter blev fremstillet ud fra frontallappen (FL), hjernestammen (BS) og cerebellum (CR), afledt fra 3 CD-1 female og 3 CD-1 hanmus i alderen 1 og 3 måneder gammel til modificeret TRAP-assay og 3 CD-1 hanmus i en alder af 2 måneder for radioaktivt TRAP analysen. Telomerase-aktivitet blev påvist i en ug proteiner ekstrakt anvendelse af den modificerede TRAP-assay og 2 ug proteiner ekstraheres i det radioaktive TRAP-assay. Påvisning af telomerase-aktivitet ved det radioaktive TRAP-assay og med den modificerede TRAP-assayet viser, at en bedre visualisering og opløsning af telomerase DNA-produkter er observeret med den modificerede assay som set af længden og intensiteten af DNA-stigen (figur 1A vs 1C og 1D). En gradvis reduktion af telomerase DNA-produkter er observeret, når faldende koncentrationer af protein ekstrakter, afledt af glioblastom U-251 cellelinje blev brugt suggestikke følsomhed modificerede TRAP-assay til påvisning af telomerase-aktivitet ved lavere koncentrationer af proteiner ekstrakt (figur 1B).
En signifikant højere telomerase-aktivitet ses i FL og BS regioner sammenlignet med CR i 3 måneder gamle hunner og hanner som det fremgår af intensiteten af DNA-båndene og længden af DNA-produkter stigen. Desuden er det vist, at der i mus overgang ind i voksenalderen telomeraseaktivitet stigninger i FL og fald i BS og CR (figur 1D). Sammenligning mellem kønnene viser, at i FL telomerase-aktivitet er højere hos kvinder i modsætning til BS og CR viser højere telomeraseaktivitet i mænd.
I væv, der udtrykker lave niveauer af telomerase-aktivitet, har vi fundet, at detektion af DNA-stigen under anvendelse af PCR er mere effektiv uden at bruge intern kontrol (IC)-primer, da IC udnytter TS som en fremadrettet primer således interferere med DNA-stige amplifikation. Reproducerbarheden af data opnås ved at gentage hvert eksperiment flere gange.
Figur 1. telomeraseaktivitet i musehjernen: Traditionel versus modificeret TRAP-assay. A) Telomerase-aktivitet i 3 hjerneregioner analyseret ved radioaktivt TRAP-assay (2 måneder gamle CD-1-hanmus, 2 ug proteiner ekstrakt). B) Følsomhed af den modificerede TRAP-assay er vist ved faldende koncentrationer af proteinerne ekstrakt afledt af glioblastom U -251 cellelinje. C, D) Telomerase-aktivitet i tre områder af hjernen af 1 (C) og 3 (D) måneder gamle CD-1 kvindelige og mandlige mus. DNA stigen starter ved 50 bp-båndet med trin 6 bp. (NC - negativ kontrol, IC- intern kontrol, BS - hjernestammen, CR - lillehjernen, FL - frontallappen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analyse af telomerase-aktivitet i mus hjernen via TRAP-assayet består af fire hovedtrin: 1) proteiner ekstraktion fra specifikke områder af hjernevæv 2) TS primerforlængelse ved telomerase - telomerase-reaktion 3) amplifikation af telomerase-reaktionsprodukter ved PCR 4 ) separation af PCR-produkter ved hjælp af høj opløsning agarosegel.
Denne modificerede TRAP assay behandler to store problemer, der rejser sig fra den traditionelle analyse: anvendelse af radioaktive dCTP er til følsom detektion af PCR-produkter og Sideadskillelse af DNA stigen. Høj opløsning agarosegel forenkler påvisning af telomerase-reaktionsprodukter (den DNA-stige) i forhold til svært at håndtere sekventering PAGE. Desuden nukleinsyre farvningen er et ikke-toksisk opløsning med høj følsomhed nødvendige til påvisning af små mængder af DNA.
Der bør lægges særlig vægt på følgende kritiske trin: 1) Idet tiden mellem væv fjernes og homogenisering til et minimum for at bevare protein-integritet 2) Chaps lysebuffer genfrysning bør undgås 3) proteinekstrakter bør holdes i portioner og optøs én gang før brug. Undgå genfrysning af prøver.
Kan der opstå problemer under trin gelfremstillingen da høj koncentration agarosegel er tilbøjelig til afsmittende og kræver stor opmærksomhed under tilberedningen. Teknikken har flere begrænsninger med nødvendigheden af at køre gel i et koldt rum. Desuden kan den lille mængde af PCR-produkter, der ikke ses på en UV-tabel.
Telomeraseaktivitet niveau varierer mellem forskellige væv og anses for at være lav i hjernen. Denne protokol giver en mere følsom påvisningsmetode sammenligne med traditionelle radioaktive assay muliggør en bedre påvisning af telomerase-aktivitet i hjernen. Selvom forskellige tidseffektive metoder er til rådighed (one step TRAP assay kits, der bruger en labeled TS primer til påvisning) disse metoder er væsentligt dyrere. Endvidere er anvendelsen af agarose eliminerer toksiske fare anvende polyacrylamidgel.
Som det fremgår af de repræsentative resultater ved anvendelse af den ovenfor beskrevne fremgangsmåde, er det muligt at påvise forskelle i telomerase-aktivitet mellem de forskellige områder af hjernen og mellem mænd og kvinder. Denne metode kan anvendes til påvisning af telomerase-aktivitet i andre normale væv med lav telomeraseaktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRAP Mix (10x) | Made manually, mix the following in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from Sigma). Aliquots are frozen at -20 °C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic Acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1 mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602 (2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
