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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Die Verwendung der Published: August 20, 2014 doi: 10.3791/51871
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Division of Cardiology, Department of Pediatrics, The Children's Hospital of Philadelphia, 2University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Abstract

Die Fremdkörperreaktion tritt auf, wenn eine Kunststoffoberfläche ist mit dem Körper eingeführt. Es wird durch die Adsorption von Blutproteinen und die anschließende Bindung und Aktivierung von Blutplättchen, Monocyten / Makrophagen-Adhäsion und entzündliche Zellsignalisierungsereignisse gekennzeichnet, was zu postoperativen Komplikationen. Chandler-Loop Vorrichtung ist ein experimentelles System, das die Forscher die molekularen und zellulären Wechselwirkungen, wenn große Blutvolumina werden über Leitungen polymeren perfundiert auftreten studieren kann. Zu diesem Zweck ist diese Vorrichtung als Ex-vivo-Modell ermöglicht die Beurteilung der entzündungshemmenden Eigenschaften der verschiedenen Polymeroberflächenmodifikationen verwendet. Unser Labor hat gezeigt, dass Blutleitungen, kovalent über Photochemie mit rekombinanten CD47 geändert können Biokompatibilität auf polymeren Oberflächen verleihen. Anhängen von CD47 auf polymeren Oberflächen könnte ein wirksames Mittel, um die Wirksamkeit der polymeren Blutleitungen zu fördern. SieEin ist die Detaillierung der Methodik der Photochemie verwendet, um rekombinantes CD47 klinisch relevante polymeren Blutleitungen und der Verwendung der Chandler-Loop als Ex-vivo-Versuchsmodell hängen, um Blut CD47-Wechselwirkungen mit den modifizierten und Steuerleitungen zu untersuchen.

Introduction

Viele klinische Verfahren, wie beispielsweise Herz-Lungen-und Nierendialyse, erfordern die Verwendung von polymeren Blutleitungen und sind oft mit postoperativen Komplikationen 1 verbunden. Wenn sie mit Blut durchströmt, diese Polymere unerlaubt die Fremdkörperreaktion (FBR), was bei der Adsorption von Blutproteinen und Thrombozyten, Monozyten / Makrophagen-Haftung, und die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen, die alle zu post-prozeduralen Komplikationen und tragen / oder Geräteausfall 2,3. So, Strategien zur Lösung dieses Problems vor ein wichtiges und laufende Bereich der Biomaterialien Forschung. Forscher haben versucht, dieses Problem durch Änderung Blutkontaktflächen mit bioaktiven Molekülen oder bioinert 4-6 anzugehen. Forschung in unserem Labor hat sich auf das Anhängen rekombinanten CD47 (recCD47) zu polymeren Biomaterialien als eine Strategie, um den FBR mildern und erhöhen die Wirksamkeit dieser Materialien. CD47 ist ein ubiquitär exprimiert transmembrane Protein mit einer bekannten Rolle in der Immun Steuerhinterziehung, verleiht Status "Selbst" auf exprimierenden Zellen 7-10 und Shows versprechen bei Übertragung der Biokompatibilität, wenn auf polymere Oberflächen 11-13 angehängt. Signal-Regulationsprotein alpha (SIRPα), der zugehörigen Rezeptor für CD47, und ein Mitglied der Immunrezeptor Tyrosin-basierte inhibitorische (ITIM) enthaltenden Familie von Transmembranproteinen, auf Zellen myeloiden Ursprungs 14 ausgedrückt. Wir haben zuvor gezeigt, dass CD47, über SIRPα-vermittelten Zellsignalisierung nach unten reguliert die Immunantworten auf Polyurethan (PU) und Polyvinylchlorid (PVC) in in vitro, ex vivo und in vivo-Modellen 11-13.

Zentral unseren Untersuchungen ist eine relativ neue Photochemie, die hier beschrieben ist, in dem chemisch reaktive Thiolgruppen, die kovalent an Polymerschlauch durch Umsetzung der Schlauch mit einem multifunktionellen Polymers (PDT-Bz fügtenPh), 2-pyridyldithio (PDT) besteht, die photoreaktive Benzophenon (BzPh) und einem carboxy-modifizierten Polyallylamin 11-13. Reduzieren der kovalent angehängt PDT Gruppen mit Tris (2-carboxyethyl) phosphin-Hydrochlorid (TCEP) 11 liefert eine Oberfläche, die anschließend thiolierten sein kann mit therapeutischen Gruppierungen umgesetzt. Und hierin vorher beschrieben 12,13, recCD47, ferner mit der Zugabe eines C-terminalen Poly-Lysin 12,13 Schwanz modifiziert mit Sulfosuccinimidyl-4-[N -maleimidomethyl] cyclohexan-1-carboxylat umgesetzt (Sulfo-SMCC) für 1 h auf Thiol-reaktive Gruppen zu erzeugen, was eine Monosulfid-Bindungen zwischen dem Schlauch und recCD47 11. Die entzündungshemmende Fähigkeit der CD47 funktionalisierten Oberflächen getestet, ex viv o, mit der Chandler-Loop Vorrichtung mit menschlichem Vollblut, das ursprünglich im Jahr 1958 beschrieben wurde als ein in vitro-Modell der Thrombose Koagulation 15. Die Vorrichtung beruht auf einergeschlossenes Rohr, das teilweise mit Luft und einen Drehmotor, um das Blut durch den Schlauch 15 zirkulieren gefüllt. Dieses Versuchsmodell bietet die Möglichkeit, die Wirkung der Blutexposition auf modifizierten und unmodifizierten Oberflächen sowie die Auswirkungen dieser Oberflächenmodifizierungen auf die Physiologie der Zellen des Blutes zu untersuchen.

recCD47 kann auf eine Vielzahl von polymeren Oberflächen mit diesen Photochemie angefügt werden, und seine entzündungshemmende Kapazität kann durch Verwendung eines klinisch relevanten ex vivo-Modell imitiert Blutperfusion auf polymeren Oberflächen 11,12 beurteilen. Klinischer Qualität Blutleitungen mit recCD47 verändert zeigen deutlich weniger Blutplättchen und Entzündungszellhaftung im Vergleich zu nicht modifizierten Polymeren, wann menschliches Blut in dem Gerät ausgesetzt. Eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung dieses Änderungsprozess wird im Folgenden aufgeführt.

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Protocol

1. Ändern Polymere Oberflächen mit recCD47

HINWEIS:. Das Protokoll ist in 1 schematisch zusammengefaßt 1A zeigt Generation von Thiol-reaktiven polymeren Oberflächen 1B zeigt Generation von Thiol-reaktiven recCD47..

  1. Tag 1
    1. Eine Lösung von PDT-BzPh (1 mg / ml) und Kaliumhydrogencarbonat (KHCO 3) (0,7 mg / ml) in sterilem Wasser. Rühren über Nacht bei 4 ° C (vor Licht schützen).
  2. Tag 2
    1. Geschnitten polymeren Schlauch in 40 cm lange Stücke (lange genug, um rotierende Räder passen herum).
    2. Einweichen Rohre in einer 0,1% igen wässrigen Lösung von hexacylpyridinium für 90 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler oder Chandler Kreisvorrichtung. Spülen Sie die Rohre mit sterilem Wasser 3x nach der 90 Minuten einweichen.
    3. Säure die Lösung von PDT-BzPh von Tag 1 durch Zugabe von 15% iger wässriger Kaliumphosphat einbasischen (KH 2 4). Fügen Sie 50 ul KH 2 PO 4 pro ml PDT-BzPh und bildet eine trübe Mizellarlösung.
    4. Weichen Sie die Rohre in der angesäuerten PDT-BzPh Lösung für 40 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler oder auf das Gerät.
    5. Spülen Sie die Rohre mit verdünnter Essigsäure (1: 1000) einmal.
    6. Setzen die Röhren UV-Bestrahlung mit einer Gesamtdauer von 60 min. Rohre drehen ¼ Umdrehung alle 15 min, um die gesamte Fläche zu bestrahlen.
    7. Einweichen der Rohre in einer Lösung von 20 mg / ml Kaliumbicarbonat (KHCO 3) für 20 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler oder Vorrichtung.
    8. Die Röhrchen mit sterilem Wasser spülen und zu speichern 3x bei 4 ° C in sterilem Wasser.
  3. Tag 3
    1. Aufzulösen 5 mg Sulfo-SMCC in 200 ul Dimethylformamid (DMF) (Achtung: Führen in Abzug).
    2. Dann werden 50 ul der Sulfo-SMCC-Lösung in Schritt 1 bis 0,1 mg / ml recCD47 Poly-Lysin-Lösung, zugegeben und 60 min bei room Temperatur.
    3. Während 60 min rühren, Degas sterile Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) und beiseite stellen.
    4. Reinigen Sulfo-SMCC reagiert recCD47 mit einem Molekulargewicht 7K Cut-off-Spin-Entsalzungssäule den Anweisungen des Herstellers. Sammeln abschließenden Durchfluss (hochwertige thiolreaktive recCD47) und verdünnt auf eine notwendige Beschichtung des Inneren des Rohres mit DPBS Volumen.
    5. Die Rohre von Tag 2 mit sterilem spülen, entgast DPBS 3x.
    6. Reagieren der modifizierten Oberfläche der Rohre mit einer Lösung von 20 mg / ml mit Tris (2-carboxyethyl) phosphin-Hydrochlorid (TCEP) in entgastem DPBS für weniger als 2 min. Spülen Sie die Rohre mit sterilem DPBS 4x entgast.
    7. Fügen Sie den Sulfo-SMCC reagierten recCD47 zu den Rohren und Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf einem Schüttler oder auf das Gerät.

2. Immunoassay Quantifizierung der recCD47 auf modifizierte Oberflächen

  1. Geändert Rohre spülen, um von Tag 3 wit quantifiziert werdenh DPBS 3x. Die Röhrchen nicht zur Quantifizierung in DPBS bei 4 ° C verwendet.
  2. Verwenden Sie ein 4 mm Biopsie Punch, um doppelte Rohrproben in Vertiefungen einer 96-Well-Platte zu machen und legen Biopsie Schläge.
  3. Bereiten Sie eine Negativkontrolle, bestehend aus einem nicht modifizierten Rohr Probe nicht mit dem Detektionsantikörper behandelt. Bereiten Sie eine Antikörperkontrolle, bestehend aus einem nicht modifizierten Rohrprobe mit dem Detektionsantikörper behandelt. Bereiten Sie die mit dem Detektionsantikörper behandelt geändert Rohr-Testproben.
  4. Block Proben mit 0,4% Rinderserumalbumin (BSA) in DPBS für 60 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler.
  5. Nach der Blockierung absaugen BSA und spülen mit Tris-gepufferte Kochsalzlösung plus 1% Tween-20 (TBST) 3x, jeweils 10 Minuten auf einem Schüttler.
  6. Bereiten Sie eine Arbeitsverdünnung des Antikörpers in 0,4% BSA nach Hersteller empfohlenen Verdünnung für Immunoassays. Verdünnte menschliche CD47-Antikörper-FITC B6H12 1: 100 in 0,4% BSA.
  7. Fügen Sie 200 ul Antikörper Verdünnung auf die entsprechenden Wells. Incubate negative Kontrollen mit nur 0,4% BSA. Inkubieren bei Raumtemperatur für 60 min auf einem Schüttler (vor Licht schützen).
  8. Spülen mit TBST 3x, jeweils auf einem Schüttler 10 min. Saugen Sie den letzten TBST spülen und mit 200 ul DPBS auf Rohrprobenvertiefungen.
  9. Sammeln Sie die letzte Durchfluss, die hochwertige thiolreaktive rekombinanten CD47 ist und zu verdünnen, um eine notwendige Beschichtung der Innenseite der Rohre mit DPBS Lautstärke.
  10. Lesen FITC Signalintensität mit Hilfe eines Mikroplatten-Reader mit FITC-Anregung (485 nm) und Emission (538 nm)-Einstellungen.
  11. Berechnen recCD47 polymere Oberfläche gebunden basierend auf Standardwerte, auf die Autofluoreszenz und unspezifische Bindung des Antikörpers Kontrollprobe.

3. Chandler Loop-Gerät Protokoll

Suchen Institutional Review Board (IRB) Genehmigung der Blutentnahme Protokoll und informierte Zustimmung Papierkram vor Beginn der Sammlung von menschlichen Blutproben. Infos zu erhaltenRmed Zustimmung von einem menschlichen Blutspender.
HINWEIS: Ein Diagramm, das die Vorrichtung ist in Figur 2 gezeigt.

  1. Füllen Wasserbad mit destilliertem Wasser bis ca. 02.01 der Durchmesser Räder sind untergetaucht. Fügen Sie genug Bleichmittel auf dem Wasserbad auf 10% Bleichmittel-Lösung zu machen. Eingestellt Wasserbad auf 37 ° C und ermöglichen Temperatur äquilibrieren.
  2. Sammeln Metalladapter (in 1B gezeigt), unmodifizierten und modifizierten Rohrschlauch und der Umgebung zusammenVorrichtung Räder, wie in 1C gezeigt. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch passt eng um das Rad mit dem Metallteil an Ort und Stelle.
  3. Erhalten 30 ml Blutprobe unter Verwendung eines IRB-genehmigten Protokoll, in einer Ampulle mit 2 ml Citrat oder anderen Antikoagulans vorgefüllt und Mischen durch Inversion der Gerinnung zu verhindern, sobald die Probe gesammelt wurde.
  4. Etwa 10 ml Blut zu jedem Röhrchen unter Verwendung der Metallventil und Spritze, so dass etwas Luft in dem Rohr. Befestigen Sie die Ventilkappe und rOtate für 3 Stunden.
  5. Lassen Sie das Blut in einen Abfallbecherglas mit einer 10% Bleichmittel-Lösung (oder, wie von institutionellen Politik erforderlich).
  6. Rohrinnen sanft spülen mit DPBS um alle Spuren von Blut zu entfernen. Sammeln Durchströmung in der Abfallbecherglas. Entsorgen von Blut im Einklang mit den institutionellen Politik.
  7. Desinfizieren Sie das Gerät und den Blutkontaktflächen mit einem 10% igen Bleichlösung oder nach institutionellen Politik.
  8. Verfahren Proben für Fluoreszenzmikroskopie oder Rasterelektronenmikroskopie, wie unten beschrieben.

4. Fluoreszenz-Mikroskopie und Zellzählung

  1. Bereiten Sie eine 4% Paraformaldehyd (PFA)-Lösung (Achtung: Führen in Abzug).
  2. Schlauch inkubieren in 4% PFA-Lösung über Nacht bei 4 ° C ist.
  3. Nach Inkubation über Nacht entfernen 4% PFA und spülen Filme sehr vorsichtig mit DPBS.
  4. Schneiden Sie den Schlauch in Abschnitte, um die Lumenoberfläche für die Färbung aus.
  5. Fleckein Abschnitt der Rohrleitung mit einigen Tropfen Befestigungsmittel 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 30 min bei Raumtemperatur (vor Licht schützen). Nach der Färbung, spülen Sie den Schlauch sehr vorsichtig mit DPBS, um Hintergrund DAPI Signal zu reduzieren.
  6. Bild unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops mit einem DAPI-Filter und Digitalkamera ausgestattet die Anzahl der Zellen in 9 blind ausgewählten Sichtfeldern unter 200facher Vergrößerung zu zählen.
  7. Rekordzelle zählt pro Gesichtsfeld und führen Sie die entsprechenden statistischen Analysen, statistische Signifikanz der Ergebnisse zu bestimmen.

5. Rasterelektronenmikroskopie

  1. Bereiten Sie eine 2% Glutaraldehyd-Lösung (Achtung: Führen in Abzug).
  2. Schlauch in einer 2% igen Glutaraldehyd-Lösung beimpft und über Nacht bei 4 ° C ist.
  3. Nach Inkubation über Nacht, sanft spülen Sie den Schlauch 3x mit DPBS.
  4. Bereiten Sie eine 1% ige Lösung von Osmiumtetroxid (Achtung: Schwere Gefährdung durch Einatmen! Verwenden Sie in Abzug).
  5. Schlauch inkubieren in einer 1% igen Lösung von Osmiumtetroxid 15 min bei Raumtemperatur.
  6. Sanft spülen Sie den Schlauch 3x mit DPBS.
  7. Vorbereiten einer Reihe von Ethanol-Konzentrationen (25%, 50%, 75%, 95% und 100% Ethanol).
  8. Dehydratisierung der Schlauch durch Inkubation in einer Reihe von Ethanolkonzentrationen. Inkubieren in 25%, 50%, 75% und 95% Ethanol für jeweils 20 min. Inkubieren in 100% Ethanol für 30 min.
  9. Überkritischen Punkt trocknen die Schläuche mit CO 2 für 45 Minuten, um alle Feuchtigkeit zu entfernen.
  10. Mount Rohrabschnitte auf einer Probe mit Stummelsilberpaste oder Graphit.
  11. Mantel Rohrabschnitte mit 12,5 nm Gold-Palladium.
  12. Untersuchen in einem Rasterelektronenmikroskop.

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Representative Results

Erzeugen Thiol-reaktiven polymeren Oberflächen durch die Verwendung von PDT-BzPh und TCEP mit Thiol-reaktiven recCD47 Poly-Lysin unter Verwendung von SMCC ermöglicht die Befestigung recCD47 auf polymeren Oberflächen. Das Modifizierungsverfahren ist schematisch in Abbildung 1 zusammengestellt. Die Bequemlichkeit des Modifikationsprozesses ist, dass sie auf viele verschiedene Proteine ​​und viele verschiedene Polymeroberflächen aufgebracht werden, vorausgesetzt, das Protein mit genügend chemisch reaktiven Gruppen, wie Amin-enthaltenden Lysine und modifiziert werden daß das Polymer ausreichend vorhanden Kohlenwasserstoffe.

Es ist zuvor gezeigt worden, daß recCD47 können auf polymere Oberflächen unter Verwendung dieses Protokolls 11-13 hängt. Wie in 3A gezeigt ist, ist bezeichnend für FITC-Färbung sichtbar recCD47 mit einem FITC-konjugierten Antikörpers an die extrazelluläre Ig-Domäne von CD47, die spezifisch an den Film lokalisiert ist, wie durch DIC-Bildgebung dargestellt(3B). Diese Ergebnisse zeigen, dass recCD47 kovalent an Polyurethanfolien angebracht werden. Messen der Fluoreszenzeinheiten und Vergleichen mit einer Standardkurve bestimmt die Konzentration der oberflächengebundenen recCD47. Wir haben gezeigt, dass recCD47 kann auf polymere Oberflächen auf einem Niveau von mehr als 500 ng / cm 2,11-13 angehängt werden. Diese Ergebnisse bestätigen, daß diese Thiol-basierte Polymermodifikation Protokoll kann verwendet werden, um Polylysin-modifizierte rekombinante Proteine, polymere Oberflächen angehängt werden.

CD47 wurde gezeigt, dass ein Marker "selbst" Verhütung von entzündlichen Zellhaftung und Aktivierung des Immunsystems 7-13. In vivo-Bedingungen so nahe wie möglich in einem ex-vivo-Situation nachahmt, kann menschliches Vollblut durch einfache und modifizierte Polymerrohrleitung im Chandler-Loop Vorrichtung perfundiert werden (in 2 gezeigt). Zellbindung an den Schlauch über DAPI-Färbung (beurteilen (Abbildung 5). Zellzählungen durch DAPI-Färbung erhalten zeigen, dass beigefügten recCD47 signifikant (p = 0,004) hemmt die Zellhaftung im Vergleich zu nicht modifizierten Oberflächen (4A und 4B). Die DAPI-Zellzahlen wurden durch SEM bestätigt, zeigt ein ähnliches Niveau der Zellbindung an unmodifizierten und modifizierten Oberflächen recCD47 (Abbildung 5). Diese Daten zeigen, dass die Anhängsel recCD47, unter Verwendung des hierin beschriebenen Protokolls, entzündliche Zellhaftung in einem ex vivo Modell der Durchblutung signifikant inhibiert.

Figur 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Oberflächenmodifikation. A) Thiolierte Polymeroberflächen wurden durch Inkubation der Polymeroberfläche mit dem Vernetzer photoaktivierbares PDT-BzPh und anschließende Reduktion mit TCEP. B) erzeugt </ Strong> SMCC wurde verwendet, um thiolreaktive recCD47, die dann mit der Kunststoffoberfläche zu thiolierte recCD47 funktionalisierten Oberflächen ergeben reagiert wurde zu produzieren.

Figur 2
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Chandler Loop-Gerät. A) Die Apparatur besteht aus einem Wasserbad auf 37 ° C, an einer Metallstange mit einem Drehmotor befestigt festen Drehräder erhitzt. Dieser Aufbau ermöglicht den Drehmotor, um die Räder zu drehen, wodurch das Eintauchen Abschnitte des Schlauchs in das 37 ° C Wasserbad und Perfusion von Blut durch den Schlauch. B) Metalladapter verwendet werden, um die Enden der Rohrleitung eine Schleife bildet, zu verbinden um eine der drehenden Räder. Blut wird in den Rohren durch die Metallventilöffnung aufgenommen und mit dem Ventilkappe. C) begrenzt Einmal montiert, ist der Schlauch und Metallventil kuscheligen ar passenound das Drehrad, wie hier mit einem Leerrohr gezeigt.

Figur 3
Abbildung 3. Quantisierung recCD47 auf Polyurethan-Filme. Antikörper gegen das äußere Ig-Domäne von CD47 gerichtet wurden verwendet, um die Menge an recCD47 Polyurethanfolien gebunden quantifizieren. Fluoreszenzmikroskop Bilder unter 200-facher Vergrößerung mit geeigneter Filtersätze, die Detektion von FITC recCD47 Polyurethan (A) angehängt genommen. (B) DIC-Bilder zeigen, dass FITC Signal spezifisch für die Polyurethan-Film ist.

Figur 4
Abbildung 4. Zelladhäsion an unmodifizierten und modifizierten Polyurethan-recCD47. Menschliches Vollblut wurde gesammelt und über perfundiert unmodifiziert oder recCD47 modifiziertenPU-Folien für 3 Stunden. Nach 3 Stunden Perfusion wurden Filme mit DPBS gewaschen und die anhaftenden Zellen wurden mit 4% PFA über Nacht bei 4 ° C fixiert und DAPI für 30 Minuten bei Raumtemperatur gefärbt. DAPI-gefärbten Zellen wurden mit einem Fluoreszenz-Mikroskop unter 200-facher Vergrößerung und entsprechenden Filtersätzen gezählt. (A) 9 zufällig ausgewählte Gesichtsfelder wurden für jede Änderung gezählt. (B) die Daten repräsentativ für 9 Sehfelder und ist als Mittelwert ± Standardabweichung (p = 0,004) ausgedrückt.

Figur 5
Abbildung 5. REM-Analyse von recCD47 modifiziert und Steuerflächen infolge der Ex-vivo-Analyse. Menschliches Vollblut wurde gesammelt und über unmodifiziert oder recCD47 modifizierten PVC-Schlauch für 3 h durchströmt. Repräsentative Bilder zeigen deutliche Zellbindung an unmodified Flächen während recCD47-modifizierten Oberflächen zeigen nur gelegentlich angebracht Zelle.

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Discussion

Die Photochemie (in Figur 1 zusammengefaßt) erlaubt die Änderung der praktisch jedem Polymeroberfläche, die ausreichend ist, um Kohlenwasserstoffe PDT-BzPh Befestigung und anschließenden UV-Bestrahlung zu erleichtern Photo aktivieren PDT-BzPh. Funktionalisierung der Polymeroberfläche mit reaktiven Thiolgruppen erlaubt die nachträgliche Montage einer Reihe von testbaren Moleküle von Interesse. In unserem speziellen Studien wählten wir rekombinanten CD47 11-13. Die besondere Konjugationschemie die wir früher umfasste die Reaktion von Amingruppen des Proteins mit dem bifunktionellen Vernetzer SMCC 11-13. Dies lieferte thiolreaktive recCD47 für die nachfolgende Reaktion mit dem thiolierten Polymeroberfläche. Das Endprodukt war eine Monosulfidbindung kovalent Binden des recCD47 auf das Polymer. Um sicherzustellen, daß die Amingruppen von den Aminosäuren in CD47 wurden nicht für die Reaktion verwendet wird, und dadurch die Wirksamkeit Milderungdes immobilisierten CD47 wir weiter modifiziert die recCD47 indem ein Poly-Lysin-Tag an das Protein die C-Terminus. Es wäre denkbar, dass eine ähnliche molekulare Strategie kann mit anderen Proteinen verwendet werden. So ist die Konjugation Chemie präsentiert hier und anderswo 11-13 bietet eine wichtige Gelegenheit, um die Fähigkeit von potentiell therapeutischen Molekülen zu Biokompatibilität auf Kunststoffoberflächen verleihen bewerten.

Ein Nachteil dieses Protokolls ist, dass Aussetzen bestimmter Arten von Polymeren, wie Polyurethan, zu längerer UV-Bestrahlung zu Verfärbungen führen. Dies kann durch Anordnen des Polymers in Polystyrol-Schalen (üblicherweise in Gewebekultur verwendet werden), um eine Verfärbung des Polymers ohne Beeinträchtigung der Photoaktivierung der PDT-BzPh verhindern vermieden werden. Die Wellenlänge von UV-Licht in diesem Protokoll verwendet wird, ist 302 nm; Abweichung von dieser Wellenlänge kann in ineffizienten Photoaktivierung der PDT-BzPh führen. Wenn mit einer anderen WellenlängeUV-Licht, ist die Optimierung der Bestrahlungszeit nötig, signifikante Photoaktivierung zu gewährleisten.

Nach diesem Protokoll ermöglicht die Befestigung recCD47 auf polymeren Oberflächen, zum Zweck der Immunumgehung und Förderzustand "Selbst" zu der Polymeroberfläche, um die Fremdkörperreaktion zu verhindern. Quantifizierung der recCD47 zur Oberfläche beigefügten abgeschlossen mit einem FITC-markierten Antikörpers an die Ig-Domäne von CD47 unter Verwendung eines Immuntests und Fluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 3). Diese Methode könnte auch auf andere Proteine ​​an Polymeroberflächen unter der Annahme, Antikörper angehängt Verfügbarkeit angepasst werden. Nicht signifikante Anhängsel recCD47 (oder ein anderes Protein) zu erhalten, kann aufgrund einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich Nicht PDT-BzPh photoaktivieren, nicht genügend Kohlenwasserstoffe auf der Polymeroberfläche, die Hydrophobie der Polymeroberfläche, oder das Polymer kann zu dick sein oder undurchsichtig, damit Licht durch angemessene quantific gebenation. Alle diese Variablen können experimentell getestet und für ein bestimmtes Polymer optimiert werden.

Die Chandler Loop-Gerät ist ein einzigartiges Werkzeug für die Ex-vivo-Analyse von menschlichem Vollblut Exposition auf polymere Oberflächen. Dieses System ähnelt der Perfusion von Blut durch klinische Blutleitungen in verschiedenen medizinischen Prozeduren verwendet, so dass die Analyse von vielen physiologischen Endpunkten mit Blut Kontaktflächen verbunden. Physiologische Endpunkte der Anhängsel recCD47 auf Polymeroberflächen wurden Zellzählungen unter Verwendung von DAPI-Färbung (4) und Rasterelektronenmikroskopie (Figur 5) eingesetzt. Andere Endpunkte können auch verwendet werden, je nach Verfügbarkeit der Hardware, beispielsweise Zellzahl vor und nach der Blutperfusion durch polymere Blutleitungen können ebenfalls verwendet werden. Im Vergleich zu nicht modifizierten Steuerflächen unabhängig, recCD47-modifizierten Oberflächen deutlich weniger eingehalten ausgestellt Zellen. Diese data legen nahe, dass recCD47 vermittelt Biokompatibilität auf polymere Oberflächen und könnte verwendet werden, um die FBR in klinischen Verfahren unter Verwendung von polymeren Blutleitungen zu verhindern.

Obwohl dies eine weit in vitro-Modell für die Durchblutung Studien verwendet, ist es in gewisser Hinsicht begrenzt. Die beiden großen Nachteile dieser Methode ergeben sich aus der Anforderung, Luft in der Röhre mit der Blutprobe enthalten. Die häufige Blut Interaktion mit Luft Leukozyten-und Thrombozytenaggregation und Protein-Denaturierung 16-18, die mit bestimmten Endpunkten beeinträchtigen kann. Zweitens bleibt die Luft an der höchsten Stelle der Schaltung, wodurch die Geschwindigkeit des Blutkreislaufs 19. Trotz der offensichtlichen Grenzen dieser Methode induziert weniger Blutschädigung als Konkurrenzverfahren 19 und dient als eine Art von Screening der Biokompatibilität Potential Biomolekülen auf Polymerblutleitungen. Sobald Kandidat Biomoleküle durch identifiziertDieses Verfahren kann die weitere Analyse durch In-vivo-Tiermodellen erhalten werden. Letztlich ist die Biokompatibilität der modifizierten Polymere ist mittels einer geeigneten in-vivo-Modellsystem bestätigt werden.

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Disclosures

Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet wurde vom National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, unter Verleihungsnummer R21 EB015612 (SJS) und dem National Heart, Lung, and Blood Institute unter Verleihungsnummer T32 HL007915 (JBS und RJL) unterstützt, der National Institut für Gesundheit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde (PFA) Thermo Scientific 58906 Caution! Use in fume hood
25% Glutaraldehyde VWR AAA17876-AP  Caution! Use in fume hood
2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH) Synthesized in lab N/A
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A3059-100G
Citrate Sigma S5770-50ML
Digital Camera Leica DC500 Out of production
Dimethylformamide (DMF) Sigma 270547-100ML Caution! Use in fume hood
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco/Life Technologies 14190-136
Fluorescent Microscope Nikon TE300
Glacial Acetic Acid Fisher Scientific A38-212 Caution! Use in fume hood
Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody Santa Cruz Biotechnology SC-12730
Osmium Tetroxide Acros Organics 197450050 Caution! Use in fume hood
Potassium Bicarbonate (KHCO3) Sigma 237205-100G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma P5655-100G
PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit) Terumo Cardiovascular Systems 60050 Most clinical-grade tubing will work
Scanning Electron Microscope JEOL JSM-T330A
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific BP358-212
Microplate Reader Molecular Devices Spectramax Gemini EM 
Sulfo-SMCC Sigma M6035-10MG Moisture Sensitive!
tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl) Thermo Scientific 20491
Tween-20 Bio-Rad 170-6531
Vectashield with DAPI Fisher Scientific H-1200 Light sensitive!
Zeba Spin Desalt Columns – 7 K MWCO Thermo Scientific 89891

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruck, S. D. Medical applications of polymeric materials. Med. Prog. Technol. 9 (1), 1-16 (1982).
  2. Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin. Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
  3. Levy, J. H., Tanaka, K. A. Inflammatory response to cardiopulmonary bypass. Ann. Thorac. Surg. 75, S715-S720 (2003).
  4. Sperling, C., Maitz, M. F., Talkenberger, S., Gouzy, M. F., Groth, T., Werner, C. In vitro blood reactivity to hydroxylated and non-hydroxylated polymer surfaces. Biomaterials. 28, 3617-3625 (2007).
  5. Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups. Biomaterials. 26, 6547-6457 (2005).
  6. Vasita, R., Shanmugam, I. K., Katt, D. S. Improved biomaterials for tissue engineering applications: surface modification of polymers. Curr. Top. Med. Chem. 8, 341-353 (2008).
  7. Subramanian, S., Parthasarathy, R., Sen, S., Boder, E. T., Discher, D. E. Species- and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPalpha. Blood. 107 (6), 2548-2556 (2006).
  8. Tsai, R. K., Discher, D. E. Inhibition of 'self' engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells. J Cell Biol. 180 (5), 989-1003 (2008).
  9. Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends Immunol. 29 (5), 203-206 (2008).
  10. Oldenborg, P. A., Zheleznyak, A., Fang, Y. F., Lagenaur, C. F., Gresham, H. D., Lindberg, F. P. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
  11. Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2001).
  12. Finley, M. J., Rauva, L., Alferiev, I. S., Weisel, J. W., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33, 5803-5811 (2012).
  13. Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34, 8640-8649 (2013).
  14. Ravetch, J. V., Lanier, L. L. Immune inhibitory receptors. Science. 290, 84-89 (2000).
  15. Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of blood: a method for producing a thrombus. Lab Invest. 7, 110-114 (1958).
  16. Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea Hyperb Med. 20 (2), 101-119 (1993).
  17. Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platlet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. Intl J of Legal Med. 111 (1), 22-26 (1998).
  18. Miller, R., Fainerman, V. B., Wüstneck, R., Krägel, J., Trukhin, D. V. Characterization of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A. 131 (1-3), 225-230 (1998).
  19. Oeveren, W. V., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. Int J Biomater. 2012, (2012).

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Bioengineering Chandler-Loop Gerät Durchblutung Biokompatibilität CD47 Fremdkörperreaktion polymere Blutleitungen
Die Verwendung der<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Chandler Loop-Gerät, um die Biokompatibilität von modifizierten polymeren Blutleitungen beurteilen
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Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy,… More

Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits. J. Vis. Exp. (90), e51871, doi:10.3791/51871 (2014).

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