En ny metode til lokalisering Reporter fluorescerende kugler nærheden cellekulturen overflade for trækkraft Microscopy
Summary
Traditionelle teknikker til fremstilling af polyacrylamid (PA), geler, der indeholder fluorescerende prober indebærer sandwiching en gel mellem en Tilhænger overflade og en glasplade. Her viser vi, at overtrække denne objektglas med poly-D-lysin (PDL) og fluorescerende prober lokaliserer prober inden for 1,6 um fra geloverfladen.
Abstract
PA geler har længe været anvendt som en platform til at studere celle trækkræfter på grund af lethed af fabrikation og evnen til at tune deres elastiske egenskaber. Når substratet er coatet med et ekstracellulært matrixprotein celler klæbe til gelen og anvende kræfter, der forårsager gelen deformeres. Deformationen afhænger cellen trækkraft og de elastiske egenskaber af gelen. Hvis deformation på overfladen er kendt, kan overfladen trækkraft beregnes ved hjælp af elasticitet teori. Gel deformation måles normalt ved at indlejre fluorescerende markør perler ensartet ind i gelen. Proberne fortrænge som gelen deformeres. Proberne nær overfladen af gelen spores. De forskydninger rapporteret af disse prober betragtes som overfladeaktive forskydninger. Deres dybder fra overfladen ignoreres. Denne antagelse introducerer fejl i trækkraft evalueringer. Til præcis måling af celle-kræfter, er det afgørende for placeringen af perlerne kendt. Vi har udvikleten teknik, der udnytter simpel kemi at begrænse fluorescerende markør perler, 0,1 og 1 um i diameter, i PA geler inden for 1,6 um af overfladen. Vi pels et dækglas med poly-D-lysin (PDL) og fluorescerende perler. PA gelopløsning derefter indlagt mellem dækglasset og en klæbende overflade. De fluorescerende perler overføre gelen opløsningen under hærdning. Efter polymerisering PA gel indeholder fluorescerende perler på et plan tæt geloverfladen.
Introduction
Den mekaniske vekselvirkning af en levende celle med sin lokale miljø er ofte blevet undersøgt ved hjælp af PA geler. Disse substrater er afhængige af en enkel, velkarakteriseret protokol er fastlagt af Dembo og Wang i 1997 1. En af de vigtigste fordele ved disse substrater er, at deres stivhed kan indstilles ved at ændre koncentrationen af bestemte komponenter i gelopløsningen. Dette giver en ønskelig platform at undersøge cellers interaktion med miljøer af forskellige stivheder. Når PA geler belagt med ekstracellulær matrix (ECM) proteiner, celler klæbe til dem, genererer kraft. Som et resultat af celle kraft gelen deformeres som et elastisk legeme. Denne deformation afhænger af størrelsen af den kraft, der påføres af cellerne, og de elastiske egenskaber af gelen. Forskellige undersøgelser har beskæftiget PA geler til at undersøge cellulære trækkræfter.
I en variation af PA-gel fabrikation, er fluorescerende mikrosfærer (perler) indlejret throughout gelen at kvantificere celle trækkræfter på geler af forskellige stivheder 2. Ved celle kraftpåvirkning, perlerne fortrænge fra deres oprindelige placering efter gel deformation. Deformationen felt er målt fra de enkelte perle forskydninger. Denne deformation felt anvendes med elasticitet teori og de elastiske egenskaber af gelen at beregne trækkræfterne. Disse målinger giver indsigt i, hvordan celler mekanisk sanse og interagere med deres lokale mikromiljø 3.
I mange udbredte PA-gel fabrikation protokoller perlerne blandes hele PA-gel i flydende, upolymeriseret tilstand. En fuldt polymeriseret PA gel indeholder fluorescerende kugler i hele dens volumen. Ved opgørelse celle trækkræfter, er perler fleste nær geloverfladen (celle-substrat interface) overvåges. Forskydningerne af disse perler er antaget at forekomme på cellekultur overflade til enkelhed i kraft calculation. Den faktiske placering af perlerne i dybden af gelen bort. Men i en elastisk (såsom PA-gel), en vulst tættere til et punkt kraftpåvirkning vil bevæge sig mere end en perle, der er længere væk fra det punkt. Således behandling af forskydning af et punkt (på perlen placering) distalt fra overfladen som på resultaterne overflade i en undervurdering af cellulære traktioner. Graden af fejl afhænger af afstanden af vulsten fra overfladen. Fejlen kan ikke beregnes uden kendskab til placeringen af perlen.
Behovet for en simpel metode til at begrænse perler meget nær cellekultur overflade er blevet behandlet med et par teknikker. En måde er at øge tætheden af perler hele gelen sådan, at der er et tilstrækkeligt antal af perler i den øverste brændplanet for at måle bevægelser meget nær overfladen. En anden teknik indebærer etablering af en konfokal billeddannelse kammer levende celler, således at lyset frakun de perler i det øverste mest fokalplan indsamles 4. En anden fremgangsmåde involverer at overlejre et ekstremt tyndt lag af PA gel indeholdende perler på toppen af en allerede polymeriseret gel uden perler 5. En ulempe ved hver af disse teknikker er, at den præcise placering af perlerne i gelen ikke er kendt. Dette indfører fejl i beregningen af feltet forskydning af perlerne og dermed beregningen af celle kræfter. En anden teknik involverer konjugering af perler til den øverste overflade af en allerede polymeriseret PA under anvendelse af Sulfo-SANPAH 6. Denne teknik sikrer perlerne er faktisk kun på toppen af PA-gel, men i hvilket omfang de er indlejret i dybden af gelen er ukendt. Dette kunne skabe en lokal topografi for cellerne, der kunne ændre celle adfærd, som tidligere arbejde har antydet, at celler kan fornemme kraft flere mikron væk 7. For nylig, en teknik til mønstring PA geler med 1 um diameter fluorescent fibronektin dot markører i en legaliseret opstilling blev etableret 8. I dette tilfælde, er dybden af fluorescerende markører er kendt, og er i det væsentlige nul, som fibronectin mønster indirekte er trykt på geloverfladen. Men denne metode ikke giver en kontinuerlig miljø, hvor cellerne kan vedhæfte, som ECM proteinet er begrænset til 1 um prikker diameter. Er endnu ikke etableret en metode til fuldt at integrere tracker perler indenfor PA geler og begrænse dem til en kendt placering meget tæt på overfladen.
Her udvikler vi en teknik til at begrænse under-um til um diameter fluorescerende kugler til en fokalplan meget nær cellekultur overflade i PA-gel. En gel er typisk hærdes ved sandwich upolymeriseret flydende gelopløsning mellem to glasplader. En af pladerne er funktionaliseret således, at gelen kraftigt klæber til det. Den anden er funktionaliseret og fjernes efter gel helbredelsesmetoder. Vi ændrer på dette flytbare glas surface ved at belægge den med et lag af perler. Ved sandwiching flydende gel mellem funktionaliserede og perlen overtrukket glasoverflade, perlerne overført til gelen, mens den hærder. Dette begrænser afstand af perlerne integration i gelen inden 1,6 um af overfladen. Glas-bund petriskåle anvendes som den klæbende overflade, på hvilken gelen er hærdet. For at danne en flad top gel overflade under polymerisationen, er et cirkulært dækglas anvendes til sandwich gelen med glasbund petriskål. Forud for gelen fabrikation, bliver det øverste dækglas coatet med poly-D-lysin (PDL), hvilket gav en positiv overfladeladning. PDL blæses med trykluft, og en opløsning af perler i vand er deponeret på dækglassene. Vi udnytter carboxylerede fluorescerende mikrokugler, som bærer en negativ ladning, og interagere med positivt ladede overflade skabt af behandling med PDL. Efter blæser perleopløsning fra dækglasset med trykluft, et enkelt lag afperler forbliver elektrostatisk koblet til den tørre dækglas. PDL belægning påvirker ikke klæbeevne af glasset til geloverfladen, da objektglas er ubeskadigede og fjernet fra PA gelen helt intakt.
Glas-bund petriskåle gøres klæbende ved behandling med 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane og 0,5% glutaraldehyd. PA geler af ønskede stivheder er skabt ved at blande passende koncentrationer af bisacrylamid og acrylamid via en standard procedure 9. En dråbe af gelen opløsningen pipetteres på glasbund petriskål. Den dækglas indeholder perlerne anvendes til sandwich gelen med petriskålen. Når gelen er hærdet, bliver det øverste dækglas fjernes forlader perler indlejret i PA-gel inden for 1,6 um fra overfladen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved brug af denne teknik, er det vigtigt, at perleopløsning er korrekt fortyndet og perlerne er valgt baseret på den ønskede diameter, PA-gel substrat stivhed og størrelsen omfanget af de fænomener, der er undersøgt i den ønskede eksperiment.
Der bør udvises forsigtighed, når fortynding perlen opløsning før funktionalisering top dækglas. Afstanden mellem perler på gelen overflade kan ændres ved at ændre fortyndingsfaktoren af kolloid opløsning. Fortynding af opløsninge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende Interdisciplinært Innovation Initiative Program, University of Illinois indrømme 12035. SK blev finansieret ved UIUC fra National Science Foundation (NSF) Tilskud 0.965.918 IGERT: Træning den næste generation af forskere i Cellulær og Molekylær Mekanik og bionanoteknologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Reagents | ||
| 97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) | Sigma-Aldrich | 281778 |
| 70% Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 111-30-8 |
| 1M HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 |
| 40% Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 |
| 2% Bisacrylamide | Sigma-Aldrich | M1533 |
| 0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry) | Invitrogen | F8801 |
| Fibronectin, Human, 1mg | BD Biosciences | 354008 |
| Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 161-0700 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-RAD | 161-0801 |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E |
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 |
| N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 |
| .05% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25300-054 |
| NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Acrylic Acid | Sigma-Aldrich | 147230 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 |
| Materials | ||
| 35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass | In Vitro Scientific | D35-14-1-N |
| Glass cover slips, 12 mm diam. | Ted Pella, Inc. | 26023 |
References
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).
- Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction. JoVE. , (2010).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses. Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
- Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -. A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-β responsiveness. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).
- Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic, M. L., Smith, A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biol. , 16 (2010).
- Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide. Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).
- Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Théry, M. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nature Materials. 11, 642-649 (2012).
- Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response. Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).
- Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinković, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology. PLoS ONE. 6 (5), e19929 (2011).
- Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).
- Tolić-Nørrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).
- Atanackovic, T., Guran, A. . Theory of Elasticity for Scientists and Engineers. , (2000).
