Un nuovo metodo per la localizzazione Reporter perline fluorescenti vicino alla superficie coltura cellulare per la trazione microscopia a forza

Summary

Le tecniche tradizionali per la realizzazione di poliacrilammide (PA) gel contenenti sonde fluorescenti comportano un gel a sandwich tra una superficie aderente e un vetrino. Qui, dimostriamo che il rivestimento questa diapositiva con poli-D-lisina (PDL) e sonde fluorescenti localizza le sonde entro 1,6 micron dalla superficie del gel.

Abstract

Gel PA sono stati a lungo utilizzati come piattaforma per studiare le forze di trazione delle cellule grazie alla facilità di fabbricazione e la possibilità di regolare le loro proprietà elastiche. Quando il substrato viene rivestito con una proteina della matrice extracellulare, le cellule aderiscono al gel e applicare forze, causando il gel di deformarsi. La deformazione dipende dalla trazione cellulare e le proprietà elastiche del gel. Se il campo di deformazione della superficie è noto, la trazione superficiale può essere calcolata utilizzando la teoria dell'elasticità. Gel deformazione viene comunemente misurata inserendo perline marcatori fluorescenti uniformemente nel gel. Le sonde spostano come il gel si deforma. Le sonde vicino alla superficie del gel sono tracciati. Gli spostamenti riportati da queste sonde sono considerati come spostamenti superficiali. Le loro profondità dalla superficie vengono ignorati. Questa ipotesi introduce errore in forza di trazione valutazioni. Per la misura precisa di forze di cellule, è fondamentale per la posizione delle perline per essere conosciuto. Abbiamo sviluppatouna tecnica che utilizza la chimica semplice confinare perline marcatori fluorescenti, 0,1 e 1 micron di diametro, in gel PA, a 1,6 micron della superficie. Abbiamo cappotto un coprioggetto con poli-D-lisina (PDL) e perline fluorescenti. Soluzione di gel PA viene quindi inserita tra il vetrino ed una superficie aderente. Le perline fluorescenti trasferimento alla soluzione di gel durante la polimerizzazione. Dopo la polimerizzazione, il gel PA contiene microsfere fluorescenti su un aereo vicino alla superficie del gel.

Introduction

L'interazione meccanica di una cellula vivente con il suo ambiente locale è stato comunemente studiata utilizzando gel PA. Questi substrati basano su un semplice protocollo ben caratterizzato stabilito da Dembo e Wang nel 1997 ^1. Uno dei principali vantaggi di questi substrati è che la loro rigidezza può essere regolato modificando le concentrazioni dei componenti specifici della soluzione di gel. Ciò fornisce una piattaforma auspicabile studiare l'interazione cellule 'con ambienti di diverse rigidità. Quando gel PA vengono rivestiti con matrice extracellulare (ECM) proteine, cellule aderiscono ad esse, la forza che genera. Come risultato della forza cella, il gel si deforma come un corpo elastico. Questa deformazione dipende dalla grandezza della forza applicata dalle cellule e le proprietà elastiche del gel. Vari studi hanno impiegato gel PA per indagare le forze di trazione cellulari.

In una variante di PA gel fabbricazione, microsfere fluorescenti (sfere) sono incorporati tel corso il gel di quantificare le forze di trazione cellulare su gel di differenti rigidità ^2. Su di applicazione della forza di cellule, le perle spostano dalla loro posizione iniziale dopo gel deformazione. Il campo di deformazione è misurata dai singoli spostamenti tallone. Questo campo di deformazione viene utilizzata con la teoria dell'elasticità e le proprietà elastiche del gel per calcolare le forze di trazione. Queste misure forniscono informazioni su come le cellule percepiscono meccanicamente ed interagiscono con il loro microambiente locale ^3.

In molti protocolli gel di fabbricazione ampiamente utilizzati PA, le perle sono mescolati in tutto il gel PA nel suo, stato liquido non polimerizzato. Un gel completamente polimerizzato PA contiene perline fluorescenti in tutto il suo volume. Nel calcolo delle forze di trazione delle cellule, perline maggior parte vicino alla superficie del gel (interfaccia cellula-substrato) sono monitorati. Gli spostamenti di queste perle si presume che si verificano sulla superficie della coltura cellulare per semplicità nella CALCOLO vigoren. La posizione attuale delle perle all'interno della profondità del gel viene ignorato. Tuttavia, in un mezzo elastico (ad esempio gel PA), una perlina più vicino al punto di applicazione della forza si muoverà più di un cordone che è più lontano dal punto. Così, trattando lo spostamento di un punto (nella posizione tallone) distale dalla superficie come che i risultati di superficie in una sottostima del trazioni cellulari. Il grado di errore dipende dalla distanza del tallone dalla superficie. L'errore non può essere definita senza la conoscenza della posizione del tallone.

La necessità di un metodo semplice per limitare perline molto vicino alla superficie di coltura cellulare è stato affrontato da alcune tecniche. Un modo è quello di aumentare la densità di perline per tutto l'arco gel tale che ci sia un numero sufficiente di perline nel piano focale superiore per misurare il movimento molto vicino alla superficie. Un'altra tecnica prevede la costruzione di una camera di imaging confocale per l'imaging cellulare dal vivo in modo tale che la luce dasolo le perline nel piano superiore più focale è raccolto ^4. Un altro metodo consiste sovrapponendo uno strato estremamente sottile di PA gel contenente microsfere sulla cima di un gel già polimerizzato, senza perline ^5. Un inconveniente di ciascuna di queste tecniche è che la posizione precisa dei branelli all'interno del gel non è noto. Questo introduce errori nel calcolo del campo di spostamenti delle perline, e quindi il calcolo delle forze cellulari. Un'altra tecnica prevede coniugazione perline alla superficie superiore di un gel PA già polimerizzato usando solfo-SANPAH ^6. Questa tecnica garantisce le perline sono infatti solo sulla parte superiore del gel PA, ma la misura in cui sono incorporati nella profondità del gel è sconosciuta. Ciò potrebbe potenzialmente creare una topografia locale per le cellule, che potrebbero alterare il comportamento delle cellule, come il lavoro preliminare ha suggerito che le cellule possono percepire forza diversi micron di distanza ^7. Recentemente, una tecnica per patterning gel PA con 1 micron di diametro fluorescent marcatori fibronectina punti in una matrice regolarizzato è stato fondato ^8. In questo caso, la profondità dei marcatori fluorescenti è noto, ed è sostanzialmente pari a zero, come il modello fibronectina è indirettamente stampata sulla superficie del gel. Tuttavia, questo metodo non fornisce un ambiente continuo in cui le cellule possono attaccare, come la proteina ECM è limitata a 1 micron di diametro puntini. Deve essere ancora stabilito un metodo per integrare pienamente perline Tracker all'interno gel PA e loro confinamento in un percorso noto molto vicino alla superficie.

Qui, sviluppiamo una tecnica per limitare sub-micron di perline fluorescenti di diametro micron ad un piano focale molto vicino alla superficie di coltura cellulare all'interno del gel PA. Un gel è tipicamente curata da sandwich non polimerizzato soluzione di gel liquido tra due lastre di vetro. Una delle piastre viene funzionalizzati in modo che il gel aderisce fortemente ad esso. L'altro è unfunctionalized e viene rimosso dopo le cure del gel. Modifichiamo questo vetro rimovibile surfaccia rivestendo con uno strato di perline. Su sandwich il gel liquido tra il funzionalizzati e la superficie di vetro tallone rivestito, il trasferimento di perline per il gel mentre sta curando. Questo limita la distanza di integrazione dei branelli 'nel gel entro 1,6 micron della superficie. Piatti con fondo di vetro Petri sono utilizzati come la superficie di adesione sulla quale è guarito il gel. Per formare una superficie superiore piana del gel durante la polimerizzazione, una circolare copertura in vetro antiscivolo è usato per sandwich di gel con la piastra di Petri con fondo di vetro. Prima di gel di fabbricazione, il coperchio superiore in vetro antiscivolo è rivestito con poli-D-lisina (PDL), ottenendo una carica superficiale positiva. Il Pdl è saltato fuori con aria compressa, e una soluzione di perline in acqua si deposita sulle coprioggetto. Utilizziamo microsfere fluorescenti carbossilati, che portano una carica negativa, e interagire con la superficie carica positiva creata dal trattamento con PDL. Dopo aver soffiato la soluzione tallone fuori il vetrino con aria compressa, un singolo strato diperline rimane elettrostaticamente accoppiati alla copertura di slittamento asciutto. Il rivestimento PDL non influenza l'adesività del vetro alla superficie del gel, i vetrini sono integri e rimossa dal gel PA completamente intatto.

Le piastre di Petri con fondo di vetro sono fatti aderente dal trattamento con il 97% a 3 amminopropil-trimethoxysliane e 0,5% glutaraldeide. PA gel di rigidità desiderati vengono creati miscelando opportune concentrazioni di bisacrilammide e acrilamide mediante una procedura standard ^9. Una goccia della soluzione di gel è pipettati sul piatto di Petri con fondo di vetro. Il vetrino di vetro contenente le perline viene utilizzato per sandwich di gel con la piastra di Petri. Quando il gel è guarito, la fodera superiore viene rimosso lasciando le sferette incorporati nel gel PA a 1,6 micron dalla superficie.

Protocol

Realizzazione e funzionalizzazione PA gel di diversa rigidità con microsfere fluorescenti incorporate in prossimità della superficie di coltura cellulare. 1 funzionalizzare i coprioggetto piano in vetro Pulire i vetrini di vetro (# 1.0, diametro 12 mm.) Con acqua e sapone, seguito da etanolo per rimuovere la polvere estranei. Posizionare il coperchio di vetro scivola su una superficie grattugiato (cioè titolare puntale) in modo che non si tocchino per facilit…

Representative Results

L'imaging confocale è stato utilizzato per determinare che le perle erano effettivamente sotto la superficie del gel e di quantificare la loro collocazione precisa all'interno della profondità di gel. Perline fluorescenti di una lunghezza d'onda diversa da quelle all'interno del gel sono stati lasciati depositare sulla superficie, e la distanza tra le nanoparticelle fluorescenti incorporate e quelle sulla superficie è stata calcolata utilizzando un algoritmo di identificazione centroide. La posizione …

Discussion

Quando si utilizza questa tecnica, è essenziale che la soluzione tallone è correttamente diluito e le perline sono scelti in base a diametro desiderato, PA substrato gel rigidità, e la scala di grandezza dei fenomeni che è esplorato nell'esperimento desiderato.

Si deve usare cautela quando si diluisce la soluzione tallone prima di funzionalizzazione migliori scivola copertura in vetro. La spaziatura tra le perle sulla superficie del gel può essere modificata variando il fattore di d…

Materials

Name	Company	Catalog Number
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)	Sigma-Aldrich	281778
70% Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	111-30-8
1M HEPES buffer solution	Sigma-Aldrich	83264
40% Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
2% Bisacrylamide	Sigma-Aldrich	M1533
0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry)	Invitrogen	F8801
Fibronectin, Human, 1mg	BD Biosciences	354008
Ammonium Persulfate	Bio-RAD	161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-RAD	161-0801
Poly-D-Lysine	Millipore	A-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)	Thermo Scientific	22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)	Thermo Scientific	24500
.05% Trypsin-EDTA (1X)	Life Technologies	25300-054
NaCL	Sigma-Aldrich	S9888
Acrylic Acid	Sigma-Aldrich	147230
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass	In Vitro Scientific	D35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam.	Ted Pella, Inc.	26023