Een nieuwe methode voor het lokaliseren van Reporter Fluorescent Beads Dichtbij de celkweek Surface voor Traction Force Microscopy
Summary
Traditionele technieken voor het vervaardigen polyacrylamide (PA) gels die fluorescente probes omvatten waartussen een gel tussen een hechtend oppervlak en een glasplaatje. Hier laten we zien dat deze dia bekleden met poly-D-lysine (PDL) en fluorescerende probes lokaliseert de probes binnen 1,6 urn uit het gel oppervlak.
Abstract
PA gels lang gebruikt als een platform om cel trekkrachten vanwege gemak van fabricage en de mogelijkheid om stemmen hun elastische eigenschappen te bestuderen. Wanneer het substraat wordt bekleed met een extracellulaire matrix eiwitten, cellen zich aan de gel en krachten toepassen, waardoor de gel te vervormen. De vervorming is afhankelijk van de cel tractie en de elastische eigenschappen van de gel. Wanneer de vervorming van het oppervlak gebied bekend is, kan het oppervlak tractie worden berekend met elasticiteitsleer. Gel vervorming wordt gewoonlijk gemeten door het inbedden fluorescente merker korrels gelijkmatig in de gel. De probes verdringen als gel vervormt. De probes nabij het oppervlak van de gel worden gevolgd. De verplaatsingen die door deze probes worden beschouwd als oppervlak verplaatsingen. Hun diepten van het oppervlak worden genegeerd. Deze aanname introduceert fout in trekkracht evaluaties. Voor nauwkeurige meting van cel krachten, is het essentieel voor de locatie van de korrels bekend zijn. We hebben ontwikkeldeen techniek die eenvoudig chemie gebruikt om fluorescente merker kralen, 0,1 en 1 urn in diameter beperken, in PA gels, op 1,6 pm van het oppervlak. We jas een dekglaasje met poly-D-lysine (PDL) en fluorescerende kralen. PA gel oplossing wordt dan ingeklemd tussen het dekglaasje en een hechtoppervlak. De fluorescerende kralen overdracht naar de geloplossing tijdens het uitharden. Na polymerisatie, de PA gel bevat fluorescerende kralen op een vlak nabij het gel oppervlak.
Introduction
De mechanische interactie van een levende cel met de lokale omgeving is algemeen bestudeerd middels PA gels. Deze substraten rekenen op een eenvoudige, goed gekarakteriseerde protocol vastgesteld door Dembo en Wang in 1997 1. Een van de belangrijkste voordelen van deze substraten is dat de stijfheid kan worden afgestemd door het modificeren van de concentraties van specifieke componenten van de gel oplossing. Dit verschaft een gewenst platform interactie van cellen met verschillende omgevingen starheid bestuderen. Wanneer PA gels worden bekleed met extracellulaire matrix (ECM) eiwitten, cellen zich aan hen kracht genereren. Door cel werking, gel vervormt als een elastisch lichaam. Deze vervorming is afhankelijk van de grootte van de door de cellen en de elastische eigenschappen van de gel toegepaste kracht. Diverse studies hebben PA gels gebruikt om cellulaire trekkrachten te onderzoeken.
In een variant van PA gel fabricage, zijn fluorescerende microbolletjes (korrels) ingebed throughout de gel naar cel trekkrachten te kwantificeren op gels van verschillende rigiditeiten 2. Bij cel kracht toepassing, de kralen te verdringen uit hun oorspronkelijke locatie volgende gel vervorming. Het veld vervorming gemeten van de afzonderlijke kraal verplaatsingen. Dit veld vervorming gebruikt elasticiteit theorie en de elastische eigenschappen van de gel om de trekkrachten berekenen. Deze metingen geven inzicht in hoe cellen mechanisch gevoel en interactie met hun lokale micro-omgeving 3.
In vele algemeen gebruikte PA gel fabricage protocollen, worden de beads vermengd gehele PA gel in vloeibare, niet-gepolymeriseerde toestand. Een volledig gepolymeriseerde PA gel bevat fluorescerende kralen gehele volume. Bij het berekenen cel trekkrachten worden beads meest nabij het gel oppervlak (cel-substraat interface) gecontroleerd. De verplaatsingen van deze kralen worden geacht plaats te hebben op de celkweek oppervlak voor eenvoud de kracht BEREKEn. De plaats van de korrels in de diepte van de gel wordt genegeerd. In een elastisch medium (zoals PA gel), een korrel dichter bij een bijzondere krachtuitoefening meer dan een kraal die verder van het te verplaatsen. Aldus behandelen van de verplaatsing van een punt (op de korrel locatie) distaal van het oppervlak dat aan het oppervlak leidt tot een onderschatting van cellulaire aandrijvingen. De mate van fouten afhankelijk van de afstand van de hiel van het oppervlak. De fout kan niet worden bepaald zonder kennis van de locatie van de kraal.
De behoefte aan een eenvoudige methode om kralen beperken vlakbij de celkweek oppervlak heeft gericht een aantal technieken. Een manier is om de dichtheid van de korrels verhogen de gehele gel zodat er voldoende kralen in de top focal plane beweging meten vlakbij het oppervlak. Een andere techniek betreft de bouw van een confocale beeldvorming kamer voor live cell imaging zodanig dat het licht vanalleen de kralen in de bovenste meest focal plane wordt verzameld 4. Een andere werkwijze omvat bedekkend een uiterst dunne laag PA gel die kralen bevatten bovenop een reeds gepolymeriseerde gel zonder kralen 5. Een nadeel van elk van deze technieken is dat de precieze locatie van de korrels in de gel niet bekend. Dit introduceert fout in de berekening van de verplaatsing gebied van de kralen, en dus de berekening van cel krachten. Een andere techniek omvat conjugatie van kralen om het bovenvlak van een reeds gepolymeriseerd PA onder toepassing Sulfo-SANPAH 6. Deze techniek zorgt de kralen zijn inderdaad alleen op de bovenkant van de PA gel, maar de mate waarin ze zijn ingebed in de diepte van de gel is onbekend. Dit kan mogelijk zorgen voor een lokale topografie voor de cellen, die het gedrag van cellen kunnen veranderen, zoals eerder werk heeft gesuggereerd dat cellen kracht enkele microns weg 7 kan voelen. Onlangs, een techniek voor patroonvorming PA gels met 1 urn diameter fluorescent fibronectine dot markers in een geregulariseerd scala opgericht 8. In dit geval wordt de diepte van de fluorescente merkers bekend, en is in wezen nul, zoals de fibronectine patroon indirect gedrukt op het gel oppervlak. Echter, deze methode geen continue omgeving waarop cellen kunnen hechten, zoals de ECM eiwit beperkt tot 1 urn diameter dots. Een methode voor het volledig integreren tracker kralen binnen PA gels en beperken ze naar een bekende locatie zeer dicht bij het oppervlak moet nog worden vastgesteld.
Hier ontwikkelen we een techniek om sub-micrometer tot micrometer diameter fluorescerende kralen te beperken tot een focal plane vlakbij de celkweek oppervlak binnen PA gel. Een gel wordt gewoonlijk uitgehard door daartussen gepolymeriseerde vloeibare geloplossing tussen twee glasplaten. Een van de platen wordt gefunctionaliseerd zodat de gel sterk opgevangen. De andere is ongefunctionaliseerde en wordt verwijderd nadat de gel kuren. We passen deze verwijderbaar glazen suce door het bekleden met een laag korrels. Bij daartussen de vloeistof gel tussen de gefunctionaliseerde en het glasoppervlak parels gecoate, de kralen overdracht aan de gel tijdens het uitharden. Dit beperkt de afstand van integratie de kralen "in de gel op 1,6 pm van het oppervlak. Glazen bodem Petrischalen worden gebruikt als het hechtende oppervlak waarop de gel wordt uitgehard. Om een platte top gel oppervlak tijdens de polymerisatie te vormen, is een ronde glazen afdekplaat slip gebruikt om sandwich de gel met de glazen bodem petrischaal. Vóór gel fabricage, wordt de bovenste glazen dekglas gecoat met poly-D-lysine (PDL), hetgeen een positieve oppervlaktelading. De PDL wordt afgeblazen met perslucht en een oplossing van korrels in water wordt afgezet op de dekglaasjes. We maken gebruik van gecarboxyleerde fluorescerende microbolletjes, die een negatieve lading te dragen, en de interactie met de positief geladen oppervlak gemaakt door behandeling met PDL. Na het blazen van de kraal oplossing van het dekglaasje met perslucht, een enkele laagbeads blijft elektrostatisch gekoppeld met de droge dekglas. De PDL coating heeft geen invloed op de kleverigheid van het glas om het gel oppervlak, zoals de objectglaasjes onbeschadigd en uit de PA gel volledig intact.
De glazen bodem Petrischalen hechtende gemaakt door behandeling met 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane en 0,5% glutaaraldehyde. PA gels gewenste starheid worden gemaakt door het mengen van geschikte concentraties bisacrylamide en acrylamide via een standaardprocedure 9. Een druppel van de gel oplossing gepipetteerd op de glazen bodem petrischaal. Het dekglaasje bevattende korrels met daartussen de gel met de petrischaal. Wanneer de gel wordt uitgehard, wordt de bovenste dekglas verwijderd waardoor de korrels ingebed in de PA gel binnen 1,6 pm van het oppervlak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bij gebruik van deze techniek, is het essentieel dat de kraal oplossing goed verdund en de korrels worden gekozen gebaseerd op de gewenste diameter, PA gel substraat stijfheid, en de omvang omvang van de verschijnselen die is onderzocht in de gewenste experiment.
Voorzichtigheid is geboden bij het verdunnen van de kraal oplossing voorafgaand aan funktionaliseren top dekglaasjes. De afstand tussen parels op het gel oppervlak kan worden veranderd door het veranderen van de verdunningsfactor va…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag het Interdisciplinair Innovation Initiative Program, Universiteit van Illinois te erkennen, verlenen 12035. SK werd gefinancierd op UIUC van National Science Foundation (NSF) Subsidie 0.965.918 IGERT: Het trainen van de volgende generatie van onderzoekers in Cellulaire en Moleculaire Mechanica en bionanotechnologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Reagents | ||
| 97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) | Sigma-Aldrich | 281778 |
| 70% Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 111-30-8 |
| 1M HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 |
| 40% Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 |
| 2% Bisacrylamide | Sigma-Aldrich | M1533 |
| 0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry) | Invitrogen | F8801 |
| Fibronectin, Human, 1mg | BD Biosciences | 354008 |
| Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 161-0700 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-RAD | 161-0801 |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E |
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 |
| N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 |
| .05% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25300-054 |
| NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Acrylic Acid | Sigma-Aldrich | 147230 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 |
| Materials | ||
| 35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass | In Vitro Scientific | D35-14-1-N |
| Glass cover slips, 12 mm diam. | Ted Pella, Inc. | 26023 |
References
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).
- Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction. JoVE. , (2010).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses. Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
- Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -. A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-β responsiveness. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).
- Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic, M. L., Smith, A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biol. , 16 (2010).
- Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide. Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).
- Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Théry, M. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nature Materials. 11, 642-649 (2012).
- Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response. Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).
- Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinković, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology. PLoS ONE. 6 (5), e19929 (2011).
- Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).
- Tolić-Nørrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).
- Atanackovic, T., Guran, A. . Theory of Elasticity for Scientists and Engineers. , (2000).
