Rapid Genotyping av Dyr Fulgt av Etablering Primære Kulturer av hjernens nerveceller

Summary

Vi beskriver prosedyrer for merking og genotyping nyfødte mus og generere primære nevronkulturer fra dem. Den genotyping er rask, effektiv og pålitelig, og gir mulighet for automatisert nukleinsyre-syre utvinning. Dette er spesielt nyttig for neonatally dødelige mus og deres kulturer som krever forutgående gjennomføring av genotyping.

Abstract

Høy oppløsning analyse av morfologi og funksjon av nerveceller fra pattedyr krever ofte genotyping av individuelle dyr, fulgt av analyse av primære kulturer av neuroner. Vi beskriver et sett av prosedyrer for: merking nyfødte mus for å bli genotypet, rask genotyping, og etablering av lav tetthet kulturer av hjernens nerveceller fra disse musene. Individuelle mus er merket med tatovering, som gir mulighet for langsiktig identifikasjon varig inn i voksenlivet. Genotyping av den beskrevne protokoll er rask og effektiv og gir mulighet for automatisert uttrekking av nukleinsyre med god pålitelighet. Dette er nyttig under omstendigheter der tilstrekkelig tid for konvensjonell genotyping ikke er tilgjengelig, for eksempel, i mus som lider av neonatal dødelighet. Primære nevronale kulturer blir generert ved lav tetthet, noe som gjør det mulig for bildebehandling eksperimenter med høy romlig oppløsning. Denne kulturen metoden krever utarbeidelse av gliaceller næringslag før nevronale plating. Protocol tilføres i sin helhet til en musemodell av bevegelsesforstyrrelse DYT1 dystoni (AE-Torsina knock-in-mus), og nevronale kulturer fremstilt fra hippocampus, cerebral cortex og striatum fra disse musene. Denne protokollen kan anvendes på mus med andre genetiske mutasjoner, så vel som til dyr av andre arter. Videre kan de enkelte komponenter av den protokoll benyttes for isolerte underprosjekter. Derfor er denne protokollen vil ha brede programmer, ikke bare i nevrovitenskap, men også i andre felt av biologiske og medisinske fag.

Introduction

Gnagermodeller av genetiske sykdommer har vist seg nyttig i å etablere de fysiologiske funksjonene til normale proteiner og nukleinsyrer, så vel som de patofysiologiske konsekvenser av defekter i disse. Eksempler inkluderer mus som mangler for proteiner som er involvert i viktige cellefunksjoner i tillegg til musemodeller av lidelser så som Alzheimers sykdom. Imidlertid kan visse genetiske manipulasjoner føre til neonatal dødelighet kort tid eller et par dager etter fødselen. I disse tilfellene, primære cellekulturer er et viktig verktøy fordi levende celler kan fås fra de embryonale eller neonatale unger før døden, de kan opprettholdes i minst et par uker in vitro, og i løpet av denne tiden tidlig neuronal utvikling kan følges av biokjemiske, funksjonelle og morfologiske eksperimenter. For de primære kulturer, kan det være gunstig å plate nervecellene ved lav tetthet; Dette gjør det mulig å visualisere den enkelte somata, dendritter, aksonal aksler og nerveklemlene på høy romlig oppløsning. Imidlertid overlevelse og differensiering av nerveceller med lav tetthet krever typisk at de er belagt på en glial mateslag, ko-dyrket med gliaceller i fravær av fysisk kontakt med dem, og dyrket i medium kondisjonert ved ^en gliaceller.

Etableringen av lav tetthet nevronale kulturer på glial næringslag kan være avhengig av en rask og pålitelig genotyping forhånd – i løpet av få timer, i motsetning til noen få dager. Hastighet er spesielt viktig når det nevronale genotype må matches til det av en glial mater lag forberedt på forhånd. Som en mer praktisk eksempel, kan det være nødvendig å bestemme hvilke unger som genotype til bruk ved generering av kulturer, for å optimalisere effektiviteten av et eksperiment.

Her demonstrerer vi arbeidsprotokollen som har vært brukt for rask, forenklet og pålitelig mus genotyping i tidligere publikasjoner ^2-6. Musehaler oget kommersielt tilgjengelig kit benyttes. Denne protokollen innbefatter ett-trinns ekstrahering av nukleinsyrer fra vevet, og krever heller ikke en nukleinsyre-syre rensetrinn eller anvendelse av en termineringsbuffer ("stopp-løsning"). Påliteligheten av denne genotyping fremgangsmåte er illustrert ved å presentere resultatene av en serie tester ved forskjeller blir innført med hensyn til utgangsmengden av prøvene, i en alder av dyrene og lengden av PCR-amplikoner. Dette settet tilbyr fordelene ved automatisert utvinning og pålitelighet.

For å få til å være omfattende, er bruken av tatovering for langsiktig identifikasjon av genotypede mus også demonstrert. Tatovering oppnås ved å påføre tatovering blekk til dermis av huden (under epidermis) ^7. En fremgangsmåte er beskrevet for tatovering poten pads av nyfødte eller en dag gamle mus, selv om tatovering kan anvendes på andre deler av kroppen, slik som haler og tær, og å Animals i alle aldre. I tillegg vil fremgangsmåten bli demonstrert for plating og dyrking mus neuroner ved en lav densitet, basert på optimal fremstilling av forskjellige typer av glial næringslag ^2,8.

Vi bruker en genetisk musemodell for den arvet nevrologisk lidelse DYT1 dystoni – en autosomal-dominant bevegelse lidelse forårsaket av en mutasjon i genet TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) ^9. Den kodede protein, Torsina, tilhører de "ATPaser forbundet med ulike cellulære aktiviteter" (AAA +) familie av proteiner, hvis medlemmer generelt utføre anstand-lignende funksjoner, bistå i: protein utfolder seg, protein-kompleks demontering, membran menneskehandel, og vesikkelfusjon ^10-13. Mutasjonen resulterer i en i-ramme sletting av et kodon for glutaminsyre, og kan føre til manifestasjon av "early-onset generalisert isolert dystoni ^'14,15. Imidlertid banenophysiological mekanismene som er ansvarlig for denne lidelsen er fortsatt dårlig forstått. I en knock-in mus modell, er mutant allel Tor1a ^tm2Wtd, nevnt heretter som Tor1a ^AE. Heterozygot AE-Torsina knock-in mus er levedyktige og genetisk ligne menneskelige pasienter med DYT1 dystoni, mens homozygot knock-in mus dør etter fødselen ^16,17, med ventetid til postnatal død påvirket av genetisk bakgrunn ^18. Tidlige død homozygot knock-in mus krever at både genotyping av dyr og etablering av nevrale kulturer er gjennomført raskt. Som et annet eksempel på genotyping, Tfap2a (transkripsjonsfaktor AP-2α, aktive enhancer bindende protein 2α) vil bli brukt. Proteinet kodet for av dette genet er viktige i regulering av flere cellulære prosesser, for eksempel proliferasjon, differensiering, overlevelse og apoptose ^19.

Protocol

MERK: Alle dyr prosedyrer utført i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Iowa. 1. Langsiktig Identifikasjon av Mus Bruke Tatovering poten Pads Immobilisere en pote med labben pad (plantar overflate) vendt eksperimentator. Hold poten med tommelen og pekefingeren. Vær forsiktig så du ikke klemme labben. MERK: Stabil immobilisering er viktig for å sikre at tatoveringen pigment er plassert inn i dermis av poten pad, og der…

Representative Results

Som et eksempel på anvendelse av denne protokollen, er representative resultatene vist for merking mus ved tatovering, pålitelig genotyping under ulike eksperimentelle forhold, og etablere primære nevrale kulturer på gliale næringslag. Tatovering Nyfødte valper ble merket på tredeputene med en tatovering system ('Newborn "i figur 1). Etikettene forble klart synlig 3 uker ('3-ukers-gamle ") og 32 ukers ald…

Discussion

Protokollen som presenteres her inkluderer prosedyrer for tatovering å merke / identifisere mus, for genotyping mus fra halen tips, og for dyrking mus hjernens nerveceller ved lav tetthet. I en runde av forsøk under anvendelse av 6-8 unger disse fremgangsmåter krever typisk ~ 0,5 timer, 4 timer og ~ ~ 2 timer, henholdsvis, ved en total på 6-7 timer. Dette gjør det praktisk for en enkelt experimenter å fullføre alle de prosedyrer som er nødvendige fra tidspunktet for valpene 'fødsel til plating av nevronale …

Materials

REAGENTS – tattooing
Machine Cleanser	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NMCR3	This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NDAR4	This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NBP01
Skin Prep Applicator	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NSPA1	Q-tip.
Skin Prep solution	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NSP01	This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS – genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)	EZ BioResearch LLC	G2001-100
2X PCR Ready Mix II	EZ BioResearch LLC	G2001-100	A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A	EZ BioResearch LLC	G2001-100	Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B	EZ BioResearch LLC	G2001-100	Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial	VWR	BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade	rpi	A20090-500	We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)	Fisher	BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl	Dot Scientific Inc	UG104-96RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl	Dot Scientific Inc	UG2020-RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl	Dot Scientific Inc	UG2812-RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp	EZ BioResearch LLC	L1001	We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp	EZ BioResearch LLC	L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder	GIBCO-Invitrogen	10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml	USA Scientific	1402-2900	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual	rpi	145660	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural	USA Scientific	1605-0000	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO	GIBCO-Invitrogen	S33102
Tris base	rpi	T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice			5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice			5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS – cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503-100MG	See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement	GIBCO-Invitrogen	17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated	BD falcon	353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml	BD falcon	353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml	BD falcon	353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml	BD falcon	352095
Countess (cell number counter) chamber slides	GIBCO-Invitrogen	C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)	Sigma-Aldrich	C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm	Pyrex	3160-101
Distilled water	GIBCO-Invitrogen	15230-147
DNase Type II	Sigma-Aldrich	D4527-200KU	Stock solution is prepared at 1500 units/20 μl = 75000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate	GIBCO-Invitrogen	10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size	Nalgene	568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size	Nalgene	569-0020
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO-Invitrogen	26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0	Carolina	633017
GlutaMAX-I	GIBCO-Invitrogen	35050-061
Hanks' Balanced Salts	Sigma-Aldrich	H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration)	Sigma-Aldrich	H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent	Sigma-Aldrich	258148-100 ML
Insulin	Sigma-Aldrich	I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka)	Sigma-Aldrich	63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free	BD Biosciences	356237	This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20°C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4°C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM)	GIBCO-Invitrogen	51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml	BD Biosciences	355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate	BD falcon	353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate	BD falcon	353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid	GIBCO-Invitrogen	10888-022
Nitric Acid	VWR	bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21	prepared in the lab		Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”	Fisher	13-678-6A	Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”	Fisher	13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Serological pipet, 2 ml	BD falcon	357507
Serological pipet, 5 ml	BD falcon	357543
Serological pipet, 10 ml	BD falcon	357551
Serological pipet, 25 ml	BD falcon	357525
Serological pipet, 50 ml	BD falcon	357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis	Sigma-Aldrich	480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich	Sigma-Aldrich	431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm	Corning	431219
Syringe, 3 ml	BD falcon	309585
Transferrin, Holo, bovine plasma	Calbiochem	616420
Trypan Blue stain, 0.4%	GIBCO-Invitrogen	T10282	This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI	Sigma-Aldrich	T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%	GIBCO-Invitrogen	25200-056
Uridine	Sigma-Aldrich	U3003-5G	Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125-mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS – immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2	Merck Millipore	AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail	Merck Millipore	NE1015