Быстрое Генотипирование животных Круги путем создания первичных культурах мозга нейронов

Summary

Мы описываем процедуры для маркировки и генотипирования новорожденных мышей и генерации первичных нейронов культур от них. Генотипирование является быстрым, эффективным и надежным, и позволяет для автоматического нуклеиновых кислот добычи. Это особенно полезно для неонатально летальных мышей и их культур, которые требуют предварительного завершения генотипирования.

Abstract

Высокое разрешение анализ морфологии и функции нейронов млекопитающих часто требует генотипирование индивидуальных животных с последующим анализом первичных культурах нейронов. Мы описываем набор процедур для: маркировка новорожденных мышей генотипировать, быстрый генотипирование, а также создание низкой плотности культуры мозга нейронов этих мышей. Индивидуальные мышей помечены татуировки, которая позволяет для долгосрочного идентификации прочного во взрослую жизнь. Генотипирование с помощью описанного протокола является быстрым и эффективным, а также позволяет для автоматического извлечения нуклеиновой кислоты с хорошей надежности. Это полезно в условиях, когда достаточно времени для обычного генотипирования недоступен, например, у мышей, которые страдают от новорожденных летальности. Первичные культуры нейронов генерируются при низкой плотности, что позволяет эксперименты изображений с высоким пространственным разрешением. Этот метод культура требует подготовки глиальных слоев фидерных до нейронов покрытия. Рrotocol применяется в полном объеме в мышиной модели в двигательные расстройства DYT1 дистонии (Е-torsinA плей-у мышей), а нейронные культуры готовят из гиппокампа, коры головного мозга и полосатом теле этих мышей. Этот протокол может быть применен к мышей с другими генетических мутаций, а также животных других видов. Кроме того, отдельные компоненты протокола могут быть использованы для изоляции суб-проектов. Таким образом, этот протокол будет иметь широкое применение не только в неврологии, но и в других областях биологических и медицинских наук.

Introduction

Моделях грызунов генетических заболеваний оказались полезными в установлении физиологических функций нормальных белков и нуклеиновых кислот, а также в патофизиологических последствий дефектов в них. Примеры включают мышей, дефицитных по белков, участвующих в ключевых клеточных функций, а также мышиные модели заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. Тем не менее, некоторые генетические манипуляции могут привести к неонатальной смертности в ближайшее время или через несколько дней после рождения. В этих случаях, первичные культуры клеток являются важным инструментом, потому что живые клетки могут быть получены из эмбриональных или новорожденных щенков до смерти, они могут сохраняться в течение по крайней мере нескольких недель в пробирке, и в течение этого времени в начале развития нейронов может сопровождаться биохимические, функциональные и морфологические эксперименты. Для первичных культур, то может быть выгодно, чтобы пластины нейроны при низкой плотности; это позволяет визуализировать отдельные somata, дендриты, аксональные валы и нервных TERMIналов с высоким пространственным разрешением. Тем не менее, выживание и дифференциацию нейронов при низкой плотности, как правило, требует, чтобы они помещают на глиальных фидерного слоя, совместно культивировали с глиальных клеток в отсутствии физического контакта с ними, или культивировали в среде обусловлено глии ^1.

Создание нейронных культур с низкой плотностью на глиальных слоев фидерных может зависеть от быстрого и надежного генотипирования заранее – в течение нескольких часов, в отличие от нескольких дней. Скорость особенно важно, когда генотип нейронов должно быть согласовано с, что из глиальной фидерного слоя, полученного заранее. В более практическом примере, это может быть необходимо, чтобы определить, какие щенки которых генотип для использования в генерирующих культур, чтобы оптимизировать эффективность эксперимента.

Здесь мы показываем, рабочий протокол, который был использован для быстрого, упрощенного и надежного генотипирования мыши в предыдущих публикациях ^2-6. Хвосты мышь икоммерчески доступного набора используются. Этот протокол включает в себя пошаговое извлечение нуклеиновых кислот из тканей, и не требует ни стадии очистки нуклеиновой кислоты, ни использование окончания буфера ('универсальное решение »). Надежность этого метода генотипирования иллюстрируется представляя результаты серии тестов, когда различия вводятся в отношении исходного количества образцов, возраст животных и длину ампликонов ПЦР. Этот набор предлагает преимущества автоматизированной добычи и надежности.

Ради того, чтобы быть всеобъемлющим, использование татуировки для долгосрочного идентификации генотипированных мышей также показали. Татуировки достигается путем применения татуировки чернила в дерму кожи (под эпидермисом) ^7. Процедура описана для татуировки подушечки лап новорожденных или 1 день старых мышей, хотя татуировки могут быть применены к другим частям тела, таких как хвосты и ног, а также AnimALS всех возрастов. Кроме того, процедуры будут продемонстрированы на покрытие и культивирование нейронов мыши при низкой плотности на основе оптимизированной подготовки различных типов глиальных фидерных слоях ^2,8.

Мы используем генетический модель мыши наследуемого неврологического расстройства DYT1 дистонии – аутосомно-доминантное заболевание, движение, вызванное мутацией в гене TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) ^9. Кодируемый белок, torsinA, принадлежит к «АТФаз, связанных с различными клеточными деятельности" (AAA +) семейства белков, члены которого в целом выполняет шаперон-как функции, помогая в: разворачивания белка, белка-комплекс разборки, торговля мембраны и слияния пузырьков ^10-13. Мутация в в рамке удаления кодона для глутаминовой кислоты, что может привести к проявлению "раннего начала обобщенной изолированные дистония» ^14,15. Тем не менее, путьophysiological механизмы, ответственные за этого расстройства остаются плохо понял. В детонации в мышиной модели, мутантный аллель является Tor1a ^tm2Wtd, указанными ниже, как Tor1a ^{& Delta; E.} Гетерозиготная & Delta; Е-torsinA плей-у мышей являются жизнеспособными и генетически мимические пациентов-людей с DYT1 дистонии, в то время как гомозиготные стучать в мыши погибают после рождения ^16,17, с задержкой в послеродовой смерти, пострадавших от генетического фона ^18. Ранняя смерть гомозиготной нокаут-мышей требует, чтобы оба генотипирование животных и создание нейронных культур быстро завершена. В качестве другого примера генотипирования Tfap2a (транскрипционный фактор AP-2α, активизируя усилитель связывания белка 2α) будет использоваться. Белок, кодируемый этим геном играет важную роль в регулировании многочисленных клеточных процессов, таких как пролиферации, дифференцировки, выживания и апоптоза ^19.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных, проведенные в этом исследовании, были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных из Университета Айовы мимо. 1. Долгосрочный Идентификация мышей с использованием Татуировка подушечки лап Остановите …

Representative Results

В качестве примера применения этого протокола, показательные результаты показаны для маркировки мышей татуировки, надежной генотипирования в различных экспериментальных условиях, а также создание первичных нейронов культур на глиальных слоев фидерных. Татуиров?…

Discussion

Протокол, представленные здесь включает в себя процедуры для татуировки для обозначения / определить мышей, для генотипирования мышей из хвостовой советы, и для культивирования нейронов мозга мыши при низкой плотности. В одном раунде экспериментов с использованием 6-8 щенков, эти проце…

Materials

REAGENTS – tattooing
Machine Cleanser	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NMCR3	This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NDAR4	This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NBP01
Skin Prep Applicator	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NSPA1	Q-tip.
Skin Prep solution	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NSP01	This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS – genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)	EZ BioResearch LLC	G2001-100
2X PCR Ready Mix II	EZ BioResearch LLC	G2001-100	A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A	EZ BioResearch LLC	G2001-100	Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B	EZ BioResearch LLC	G2001-100	Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial	VWR	BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade	rpi	A20090-500	We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)	Fisher	BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl	Dot Scientific Inc	UG104-96RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl	Dot Scientific Inc	UG2020-RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl	Dot Scientific Inc	UG2812-RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp	EZ BioResearch LLC	L1001	We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp	EZ BioResearch LLC	L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder	GIBCO-Invitrogen	10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml	USA Scientific	1402-2900	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual	rpi	145660	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural	USA Scientific	1605-0000	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO	GIBCO-Invitrogen	S33102
Tris base	rpi	T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice			5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice			5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS – cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503-100MG	See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement	GIBCO-Invitrogen	17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated	BD falcon	353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml	BD falcon	353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml	BD falcon	353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml	BD falcon	352095
Countess (cell number counter) chamber slides	GIBCO-Invitrogen	C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)	Sigma-Aldrich	C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm	Pyrex	3160-101
Distilled water	GIBCO-Invitrogen	15230-147
DNase Type II	Sigma-Aldrich	D4527-200KU	Stock solution is prepared at 1500 units/20 μl = 75000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate	GIBCO-Invitrogen	10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size	Nalgene	568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size	Nalgene	569-0020
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO-Invitrogen	26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0	Carolina	633017
GlutaMAX-I	GIBCO-Invitrogen	35050-061
Hanks' Balanced Salts	Sigma-Aldrich	H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration)	Sigma-Aldrich	H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent	Sigma-Aldrich	258148-100 ML
Insulin	Sigma-Aldrich	I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka)	Sigma-Aldrich	63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free	BD Biosciences	356237	This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20°C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4°C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM)	GIBCO-Invitrogen	51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml	BD Biosciences	355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate	BD falcon	353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate	BD falcon	353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid	GIBCO-Invitrogen	10888-022
Nitric Acid	VWR	bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21	prepared in the lab		Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”	Fisher	13-678-6A	Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”	Fisher	13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Serological pipet, 2 ml	BD falcon	357507
Serological pipet, 5 ml	BD falcon	357543
Serological pipet, 10 ml	BD falcon	357551
Serological pipet, 25 ml	BD falcon	357525
Serological pipet, 50 ml	BD falcon	357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis	Sigma-Aldrich	480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich	Sigma-Aldrich	431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm	Corning	431219
Syringe, 3 ml	BD falcon	309585
Transferrin, Holo, bovine plasma	Calbiochem	616420
Trypan Blue stain, 0.4%	GIBCO-Invitrogen	T10282	This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI	Sigma-Aldrich	T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%	GIBCO-Invitrogen	25200-056
Uridine	Sigma-Aldrich	U3003-5G	Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125-mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS – immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2	Merck Millipore	AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail	Merck Millipore	NE1015