Snabb Genotypning av djur Följt av Etablera Primära kulturer av hjärnans nervceller

Summary

Vi beskriver rutiner för märkning och genotypning nyfödda möss och generera primära neuronala kulturer från dem. Den genotypning är snabb, effektiv och tillförlitlig, och möjliggör automatiserad nukleinsyra-sur extraktion. Detta är särskilt användbart för neonatalt dödliga möss och deras kulturer som kräver förhands avslutad genotypning.

Abstract

Högupplöst analys av morfologi och funktion av däggdjurs neuroner kräver ofta genotypning av enskilda djur följt av analys av primärkulturer av nervceller. Vi beskriver en rad förfaranden för: märkning nyfödda möss som ska genotypats, snabb genotypning, och etablera låg densitet kulturer av hjärnans nervceller från dessa möss. Individuella möss är märkta med tatuering, vilket möjliggör långsiktig identifiering varar i vuxen ålder. Genotypning av den beskrivna protokollet är snabb och effektiv, och möjliggör automatisk extraktion av nukleinsyra med god tillförlitlighet. Detta är användbart under omständigheter där tillräcklig tid för konventionell genotypning är inte tillgänglig, t.ex., i möss som lider av neonatal dödlighet. Primära neuronala kulturer genereras vid låg densitet, vilket möjliggör avbildning experiment vid hög rumslig upplösning. Denna kultur metoden kräver beredning av gliaceller feeder lager före neuronal plätering. Den protocol tillämpas i sin helhet till en musmodell av rörelsestörning DYT1 dystoni (AE-Torsina knock-in möss) och neuronala kulturer framställs av hippocampus, hjärnbarken och striatum av dessa möss. Detta protokoll kan tillämpas på möss med andra genetiska mutationer, samt andra djurarter. Dessutom kan enskilda komponenterna i det protokoll användas för isolerade delprojekt. Detta protokoll kommer således att ha breda program, inte bara i neurovetenskap men även inom andra områden för biologiska och medicinska vetenskaper.

Introduction

Gnagarmodeller av genetiska sjukdomar har visat sig användbara i att fastställa de fysiologiska funktionerna av normala proteiner och nukleinsyror, liksom de patofysiologiska följderna av defekter i dessa. Exempel inkluderar mus med brist på proteiner involverade i viktiga cellulära funktioner, samt musmodeller av sjukdomar som Alzheimers sjukdom. Dock kan vissa genetiska manipulationer leda till neonatal dödlighet inom kort eller ett par dagar efter födseln. I dessa fall, primära cellkulturer är ett viktigt verktyg eftersom levande celler kan erhållas från de embryonala eller neonatala valpar före döden, kan de hållas i minst ett par veckor in vitro, och under denna tid tidiga neuronala utvecklingen kan följas av biokemiska, funktionella och morfologiska experiment. För de primära kulturer, kan det vara fördelaktigt att plätera nervceller vid låg densitet; Detta gör det möjligt att visualisera den enskilde somata, dendriter, axonal axlar och nerv terminaler vid hög spatial upplösning. Emellertid kräver överlevnad och differentiering av neuroner vid låg densitet typiskt att de stryks ut på en glial matarskikt, samodlades med gliaceller i frånvaro av fysisk kontakt med dem, eller odlades i medium betingad av Glia ^1.

Inrättandet av låg densitet neuronala kulturer på gliaceller feeder lager kan vara beroende av snabb och tillförlitlig genotypning förhand – inom några timmar i motsats till ett par dagar. Snabbhet är särskilt viktigt när det neuronala genotyp måste matchas till det av en gliaceller feeder lager förberett i förväg. Som ett mer praktiskt exempel, kan det vara nödvändigt att bestämma vilket ungar av vilka genotyp till användning vid generering kulturer, för att optimera effektiviteten i ett experiment.

Här kan vi visa arbetsprotokoll som har använts för snabb, förenklad och tillförlitlig mus genotypning i tidigare publikationer ^2-6. Mus svansar ochett kommersiellt tillgängligt kit används. Detta protokoll innehåller ett steg extraktion av nukleinsyror från vävnaden, och kräver varken en nukleinsyra-syrareningssteg eller användning av en uppsägning buffert ("stop lösning"). Tillförlitligheten denna genotypning metod illustreras genom att presentera resultatet av en serie tester när skillnaderna införs med avseende på utgångsbeloppet för prover, ålder djuren och längden av PCR amplikoner. Detta kit erbjuder fördelarna med automatiserad extraktion och tillförlitlighet.

För tydlighetens vara heltäckande, är användningen av tatuering för långsiktig identifiering av genotypade mössen också visat. Tatuering uppnås genom applicering av tatuering bläck till dermis i huden (under epidermis) ^7. Ett förfarande beskrivs för att tatuering paw kuddar av nyfödda eller en dag gamla möss, fastän tatueringar kan tillämpas på andra delar av kroppen, såsom svansar och tår, och att Animals i alla åldrar. Dessutom kommer förfaranden att demonstreras för plätering och odling mus nervceller vid en låg densitet, baserat på optimerad framställning av olika typer av gliala matarskikt ^2,8.

Vi använder en genetisk musmodell av ärftlig neurologisk sjukdom DYT1 dystoni – en autosomalt dominant rörelse sjukdom som orsakas av en mutation i genen TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG, p.Glu302del / p.Glu303del) ^9. Den kodade proteinet, Torsina, tillhör de "ATPaser förknippade med olika cellulära aktiviteter" (AAA +) familj av proteiner, vars medlemmar vanligtvis utför eskortering liknande funktioner, hjälpa till: protein utspelas, protein-komplex demontering, membran trafficking och vesikelfusion ^10-13. De mutation resulterar i en in-frame radering av ett kodon för glutaminsyra, och kan leda till manifestation av "tidig debut gener isolerade dystoni" ^14,15. Men vägenophysiological mekanismer som ansvarar för denna sjukdom är fortfarande dåligt kända. I en knock-in musmodell är den mutanta allelen Tor1a ^tm2Wtd, nämns nedan som Tor1a ^AE. Heterozygot AE-Torsina knock-in möss är livskraftiga och genetiskt härma mänskliga patienter med DYT1 dystoni, medan homozygota knock-i möss dör efter födseln ^16,17, med latensen till postnatal död påverkas av genetisk bakgrund ^18. Den tidiga död homozygot knock-i möss kräver att både genotypning av djur och inrättandet av neuronala kulturer snabbt klar. Som ett annat exempel på genotypning, Tfap2a (transkriptionsfaktor AP-2α, aktiverande förstärkare bindande protein 2α) kommer att användas. Proteinet kodat av denna gen är viktig vid reglering av flera cellulära processer, såsom proliferation, differentiering, överlevnad och apoptos ^19.

Protocol

OBS: Alla djurförsök som utförs i denna studie har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Iowa. 1. Långsiktigt Identifiering av möss Använda Tatuering tassen Pads Immobilisera en tass med tassen pad (plantar yta) vänd försöks. Håll tassen med tummen och pekfingret. Var noga med att inte klämma tassen. OBS: Stabil immobilisering är viktigt att säkerställa att tatuering pigmentet placeras in i dermis av tassen dynan, …

Representative Results

Som ett exempel på tillämpningen av detta protokoll, är representativa resultat visas för märkning möss genom tatuering, tillförlitlig genotypning under olika experimentella förhållanden, och upprättande av primära neuronala kulturer på gliaceller feeder lager. Tatuering Nyfödda valpar märktes på trampdynor med en tatuering-system ("Newborn" i figur 1). Etiketterna förblev väl synlig på 3 veckor ('…

Discussion

Protokollet presenteras här ingår förfaranden för tatuering att märka / identifiera möss, för genotypning möss från svans tips och för odling mus hjärnans nervceller vid låg densitet. I en omgång av experiment med 6-8 valpar, dessa förfaranden kräver normalt ~ 0,5 h, ~ 4 timmar och ~ 2 tim respektive till totalt 6-7 tim. Detta gör det praktiskt för en enda försöks att slutföra alla nödvändiga förfaranden från tiden för valparna "födelse till plätering av neuronala kulturer – på mindre ä…

Materials

REAGENTS – tattooing
Machine Cleanser	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NMCR3	This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NDAR4	This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NBP01
Skin Prep Applicator	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NSPA1	Q-tip.
Skin Prep solution	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NSP01	This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS – genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)	EZ BioResearch LLC	G2001-100
2X PCR Ready Mix II	EZ BioResearch LLC	G2001-100	A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A	EZ BioResearch LLC	G2001-100	Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B	EZ BioResearch LLC	G2001-100	Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial	VWR	BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade	rpi	A20090-500	We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)	Fisher	BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl	Dot Scientific Inc	UG104-96RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl	Dot Scientific Inc	UG2020-RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl	Dot Scientific Inc	UG2812-RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp	EZ BioResearch LLC	L1001	We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp	EZ BioResearch LLC	L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder	GIBCO-Invitrogen	10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml	USA Scientific	1402-2900	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual	rpi	145660	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural	USA Scientific	1605-0000	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO	GIBCO-Invitrogen	S33102
Tris base	rpi	T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice			5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice			5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS – cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503-100MG	See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement	GIBCO-Invitrogen	17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated	BD falcon	353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml	BD falcon	353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml	BD falcon	353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml	BD falcon	352095
Countess (cell number counter) chamber slides	GIBCO-Invitrogen	C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)	Sigma-Aldrich	C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm	Pyrex	3160-101
Distilled water	GIBCO-Invitrogen	15230-147
DNase Type II	Sigma-Aldrich	D4527-200KU	Stock solution is prepared at 1500 units/20 μl = 75000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate	GIBCO-Invitrogen	10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size	Nalgene	568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size	Nalgene	569-0020
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO-Invitrogen	26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0	Carolina	633017
GlutaMAX-I	GIBCO-Invitrogen	35050-061
Hanks' Balanced Salts	Sigma-Aldrich	H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration)	Sigma-Aldrich	H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent	Sigma-Aldrich	258148-100 ML
Insulin	Sigma-Aldrich	I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka)	Sigma-Aldrich	63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free	BD Biosciences	356237	This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20°C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4°C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM)	GIBCO-Invitrogen	51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml	BD Biosciences	355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate	BD falcon	353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate	BD falcon	353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid	GIBCO-Invitrogen	10888-022
Nitric Acid	VWR	bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21	prepared in the lab		Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”	Fisher	13-678-6A	Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”	Fisher	13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Serological pipet, 2 ml	BD falcon	357507
Serological pipet, 5 ml	BD falcon	357543
Serological pipet, 10 ml	BD falcon	357551
Serological pipet, 25 ml	BD falcon	357525
Serological pipet, 50 ml	BD falcon	357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis	Sigma-Aldrich	480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich	Sigma-Aldrich	431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm	Corning	431219
Syringe, 3 ml	BD falcon	309585
Transferrin, Holo, bovine plasma	Calbiochem	616420
Trypan Blue stain, 0.4%	GIBCO-Invitrogen	T10282	This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI	Sigma-Aldrich	T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%	GIBCO-Invitrogen	25200-056
Uridine	Sigma-Aldrich	U3003-5G	Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125-mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS – immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2	Merck Millipore	AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail	Merck Millipore	NE1015