הכנת Synaptic פלזמה ממברנה וחלבוני צפיפות Postsynaptic באמצעות שיפוע סוכרוז רציף
Summary
מאמר זה מפרט את ההעשרה של חלבונים הקשורים עם קרום הפלזמה הסינפטי על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז רציף. ההכנה הבאה של חלבוני צפיפות פוסט סינפטי מתואר גם. הכנות חלבון מתאימות למערבי סופג או ניתוח 2D DIGE.
Abstract
טכניקות חלוקה subcellular עצביות מאפשרות כימות של חלבונים שנסחרים ומסינפסה. כפי שתואר במקור בשנתי ה -1960 מאוחר, חלבונים הקשורים עם קרום הפלזמה הסינפטי יכולים להיות מבודדים על ידי ultracentrifugation בשיפוע צפיפות סוכרוז. ברגע שקרומים הסינפטי מבודדים, המורכב macromolecular ידוע כצפיפות פוסט סינפטי יכול להיות מבודד לאחר מכן בשל insolubility חומר הניקוי שלה. הטכניקות המשמשות כדי לבודד ממברנות פלזמה הסינפטי וחלבוני צפיפות פוסט סינפטי יישארו זהה במהות לאחר 40 שנים, ונמצאות בשימוש נרחב במחקר מדעי המוח נוכחי. מאמר זה מפרט את חלוקה של חלבונים הקשורים עם קרום הפלזמה הסינפטי וצפיפות פוסט סינפטי באמצעות שיפוע סוכרוז רציף. הכנות חלבון וכתוצאה מכך מתאימות למערבי סופג או ניתוח 2D DIGE.
Introduction
נוירונים לתקשר באמצעות סינפסות, ואיכות תקשורת זה מוסדרת במידה רבה על ידי שינויים בהרכב החלבונים בסינפסה. בפרט, החלבונים הממוקמים בצפיפות פוסט סינפטי להשתתף בתקשורת עצבית על ידי קולטני הנוירוטרנסמיטר אינטימי פיגומים עם מערכות העברת האותות שלהם 1. יתר על כן, שינויים מתמשכים בכוחו של היעילות הסינפטית נשלטים על ידי התוספת או גריעה של קולטנים בצפיפות פוסט סינפטי 1-6. לכן, הבידוד והכימות של חלבונים סינפטיים הוא טכניקה הכרחית ושימושית כדי לקבל תובנה הדרכים שנוירונים מגיבים לגירויים ולשנות יעילות הסינפטית 7. מאמר זה מתאר טכניקה נפוצה לבודד חלבונים סינפטיים מרקמת המוח של מכרסמים על ידי ultracentrifugation על הדרגתיים סוכרוז רציף. חלק קרום פלזמה הסינפטי יכול להיות מועשר ומבודד המבוסס עלצפיפותה בסוכרוז, שנקבע באופן אמפירי להיות דומה ל1.2 M סוכרוז.
בהתאם לשאלה הביולוגית, ניתן להפריד שברים subcellular על ידי הדרגתיים רציף או רציף של שני סוכרוז או Percoll. הדרגתיים רציף יאפשר להפרדת חלבונים לשברים מרובים; זו יכולה להיות שימושית במיוחד כדי להדגים את שיתוף הלוקליזציה של חלבונים בתוך שבריר נתון 8. עם זאת, הכנת הדרגתיים רציף היא מפרכת יותר, ואין צורך ליישומים רבים. הדרגתיים רציף קלים יותר יחסית להכנה וניתן להשתמש בם כדי להפריד בין חלבונים לכמה שברים, בדרך כלל מוגדרים. הדרגתיים רציף שמורכבים משלוש שכבות סוכרוז של molarity הגדלת היה בשימוש נרחב לבודד את חלבונים הקשורים לממברנה הסינפטי הפלזמה (SPM). חלק קרום פלזמה הסינפטי זה יכול להיות מעובד בהמשך לfractio צפיפות פוסט סינפטיn (PSD) על ידי טיפול בחומר ניקוי ובידוד של חלק חומר הניקוי מסיס.
כאשר תהליך זה תואר לראשונה בשנתי ה -1960 9,10, במיקרוסקופ אלקטרונים שימש כדי להדגים את האברונים וקרומים כי בערך להגדיר את קרום הפלזמה הסינפטי ושברים צפיפות פוסט סינפטי 9-14. מחקרים אלה הוכיחו את ההכללה של ממברנות של לפני ואחרי הסינפטי ושלפוחית סינפטית בשבריר SPM; לאחר טיפול חומר ניקוי בעיקר האלקטרונים צפופים, צפיפות פוסט סינפטי היתה גלויות לעין. בהליך, הלם hypotonic משמש ללצבוט את התהליכים סינפטיים מהגוף התא 10. צעד זה מנצל את העובדה שהמיטוכונדריה הן עמידה יותר בפני זעזועים האוסמוטי ונותרה על כנן, ולכן הם המשקע בתחתית שיפוע סוכרוז (איור 1).
שימוש באותה טכניקת העשרה זו, שברי SPM וPSD היו ראשון ביוכימיתשהוגדר על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide ורצף של רכיבי החלבון העיקריים 15-17. ניתוח כתם בהמשך המערבי נעשה שימוש כדי לזהות ולכמת את הרמות של חלבונים סינפטיים ועוד להגדיר שברים אלה (איור 2). יש לנו להשתמש בטכניקה זו במעבדות שלנו לכמת את השינויים ברמות הסינפטי של טרנספורטר דופאמין המתרחשות כאשר מוקד Slc6a3 משוכפל בעכברים 18. יש לנו גם השתמשתי בטכניקה זו בעכברים חסרי קולטן NMDA לחשוף ירידות סינפסה הספציפית בחלבונים שהם חלק מinteractome DISC1 19.
זה בא לידי ביטוי מניתוח כתם מערבי שברי SPM מכילים חלבונים סינפטיים קרום שלפוחית, סמני endosome, חלבוני המיטוכונדריה, אנזימים סינטטיים קרום הקשורים ומולקולות הולכים אותות, כמו גם רכיבים נפרד מצפיפות פוסט סינפטי וממברנות פלזמה הסינפטי 20-23. Eשברים PSD ven יכולים להיות זיהום עם חלבוני המיטוכונדריה בשפע וייתכן שיהיה צורך לבצע שקיעת שיפוע שנייה או שלבים לטיהור נוספים כדי להסיר אותם 13. לאחרונה, ספקטרומטריית מסה כמותית סיפקה רשימה של מעל 100 חלבונים בצפיפות פוסט סינפטי לבד, כמו גם אינדיקציה לשפע היחסי של רכיבים אלה 24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש כמה שלבים בהליך שהם קריטיים לתוצאה מוצלחת. בשלב 3, חשובה שמידת הומוגניות עקבית מושגת עבור כל דגימה. כאשר מאחד רקמה עם homogenizer המנוע מונע, מהירות קבועה משמשת לא רק לסיבוב של העלי, אלא גם עם מספר משיכות. זמן הדגירה בהלם אוסמוטי צריך להיות מדויק, שכן יצירת הומוגניות או דג?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).
Materials
| 1M HEPES, pH 7.4 | BioShop | HEP003.100 | |
| HEPES | BioShop | HEP001.500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507.1 | |
| EDTA | BioBasic | EB0185 | |
| PMSF | BioShop | PMS123.5 | |
| Aprotinin | BioShop | APR600.1 | |
| Leupeptin | BioShop | LEU001.1 | |
| Pepstatin | BioShop | PEP605.5 | |
| Benzamidine | BioShop | BEN601.25 | |
| Sodium fluoride | BioShop | SFL001.100 | |
| Sodium pyrophosphate | BioShop | SPP310.100 | |
| Sodium orthovanadate | BioShop | SOV664.10 | |
| β-glycerophosphate | BioShop | GYP001.10 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX506.500 | |
| 18G x 1 ½” needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog number | |
| Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 | VWR | KT885450-0023 | |
| IKA Model RW 16 Basic Stirrer | IKA Works | 2572100 | |
| Sorvall SM-24 Fixed Angle Rotor | ThermoScientific | 29017 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | ThermoScientific | 46910 | |
| Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL) | Beckman Coulter | 331372 | |
| SW 41 Ti Rotor Swinging Bucket | Beckman Coulter | 331362 | |
| Beckman L-80 Floor Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL) | Beckman Coulter | 349622 | |
| TLA-100.3 Fixed Angle Rotor | Beckman Coulter | 349481 | |
| Beckman TL-100 Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter |
References
- Delint-Ramirez, I., et al. In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).
- Wang, Q., et al. The psychiatric disease risk factors DISC1 and TNIK interact to regulate synapse composition and function. Mol Psychiatry. 16, (2010).
- Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28, 511-525 (2000).
- Tomita, S., Fukata, M., Nicoll, R. A., Bredt, D. S. Dynamic interaction of stargazin-like TARPs with cycling AMPA receptors at synapses. Science. 303, 1508-1511 (2004).
- Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54, 447-460 (2007).
- Bats, C., Groc, L., Choquet, D. The interaction between Stargazin and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking. Neuron. 53, 719-734 (2007).
- Ehlers, M. D. Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system. Nat Neurosci. 6, 231-242 (2003).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Rodriguez de Lores, A., Alberici, M., De Robertis, E. Ultrastructural and enzymic studies of cholinergic and non-cholinergic synaptic membranes isolated from brain cortex. Journal of Neurochemistry. 14, 215-225 (1967).
- Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J Anat. 96, 79-88 (1962).
- Cotman, C. W., Taylor, D. Isolation and structural studies on synaptic complexes from rat brain. J Cell Biol. 55, 696-711 (1972).
- Cotman, C. W., Banker, G., Churchill, L., Taylor, D. Isolation of postsynaptic densities from rat brain. The Journal of Cell Biology. 63, 441-455 (1974).
- Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities. The Journal of Cell Biology. 86, 831-845 (1980).
- Jones, D. H., Matus, A. I. Isolation of synaptic plasma membrane from brain by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation. Biochim Biophys Acta. 356, 276-287 (1974).
- Kennedy, M. B., Bennett, M. K., Erondu, N. E. Biochemical and immunochemical evidence that the “major postsynaptic density protein” is a subunit of a calmodulin-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80, 7357-7361 (1983).
- Moon, I. S., Apperson, M. L., Kennedy, M. B. The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 3954-3958 (1994).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4405-4410 (2008).
- Ma, D. K., et al. Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis. Science. 323, 1074-1077 (2009).
- Budreck, E. C., Scheiffele, P. Neuroligin-3 is a neuronal adhesion protein at GABAergic and glutamatergic synapses. The European Journal of Neuroscience. 26, 1738-1748 (2007).
- Wu, J., et al. Arc/Arg3.1 regulates an endosomal pathway essential for activity-dependent beta-amyloid generation. Cell. 147, 615-628 (2011).
- Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation. J Cell Biol. 96, 1374-1388 (1983).
- Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity. Brain Res. 109, 285-309 (1976).
- Cheng, D., et al. Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 5, 1158-1170 (2006).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning : a Laboratory Manual. , (1989).
- Eggena, M., et al. Identification of histone H1 as a cognate antigen of the ulcerative colitis-associated marker antibody pANCA. J Autoimmun. 14, 83-97 (2000).
- Salahpour, A., et al. Homodimerization of the beta2-adrenergic receptor as a prerequisite for cell surface targeting. J Biol Chem. 279, 33390-33397 (2004).
- Bernocco, S., et al. Sequential detergent fractionation of primary neurons for proteomics studies. Proteomics. 8, 930-938 (2008).
- Grunewald, T. G., et al. Nuclear localization and cytosolic overexpression of LASP-1 correlates with tumor size and nodal-positivity of human breast carcinoma. BMC Cancer. 7, 198 (2007).
- Heimann, K., Percival, J. M., Weinberger, R., Gunning, P., Stow, J. L. Specific isoforms of actin-binding proteins on distinct populations of Golgi-derived vesicles. J Biol Chem. 274, 10743-10750 (1999).
- Neff, R. A., Gomez-Varela, D., Fernandes, C. C., Berg, D. K. Postsynaptic scaffolds for nicotinic receptors on neurons. Acta Pharmacol Sin. 30, 694-701 (2009).
- Cella, N., Cornejo-Uribe, R. R., Montes, G. S., Hynes, N. E., Chammas, R. The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells. Differentiation. 61, 113-120 (1996).
- Otera, H., et al. Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import. Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).
- Goubaeva, F., et al. Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).
- Lamers, K. J., et al. Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients. Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).
- Arunachalam, L., et al. Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells. Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).
- Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina. Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).
