Preparação do Synaptic Plasma Membrane e Proteínas de densidade pós-sinápticos Usando um gradiente de sacarose descontínuo
Summary
Este artigo fornece detalhes sobre o enriquecimento de proteínas associadas com a membrana de plasma sináptico por ultracentrifugação num gradiente de sacarose descontínuo. A elaboração definitiva de proteínas de densidade pós-sináptica é também descrito. Preparações de proteínas são adequados para western blot ou análise 2D DIGE.
Abstract
Técnicas de fraccionamento subcelular neuronais permitir a quantificação de proteínas, que são objecto de tráfico de e para a sinapse. Tal como foi inicialmente descrito, no final dos anos 1960, as proteínas associadas à membrana plasmática sináptica pode ser isolado por ultracentrifugação em gradiente de densidade de sacarose. Uma vez que as membranas sinápticas são isolados, o complexo macromolecular conhecido como a densidade pós-sináptica pode ser subsequentemente isolado devido à sua insolubilidade em detergente. As técnicas utilizadas para isolar membrana plasmática sináptica e proteínas de densidade pós-sináptica permanecer essencialmente o mesmo depois de 40 anos, e são amplamente utilizados em pesquisas de neurociência atual. Este artigo fornece detalhes sobre o fraccionamento de proteínas associadas com a membrana plasmática sináptica e pós-sináptica de densidade utilizando um gradiente de sacarose descontínuo. Resultantes preparações de proteínas são adequados para western blot ou análise 2D DIGE.
Introduction
Os neurônios se comunicam através de sinapses, ea qualidade desta comunicação é regulado, em grande medida por alterações na composição das proteínas na sinapse. Em particular, as proteínas localizadas na densidade pós-sináptica participar na comunicação neuronal por receptores de neurotransmissores intimamente andaime com os seus sistemas de transdução de sinal 1. Além disso, alterações na duração da força de eficácia sináptica são controladas por meio da adição ou remoção de receptores na densidade pós-sináptica 1-6. Portanto, o isolamento e quantificação de proteínas sinápticas é uma técnica útil e necessário para obter insights sobre os caminhos que os neurônios respondem a estímulos e alterar eficácia sináptica 7. Este artigo descreve uma técnica comum para isolar proteínas sinápticas de tecido cerebral dos roedores por ultracentrifugação em gradiente de sacarose descontínuo. A fracção de membrana de plasma sináptico podem ser enriquecidas e isoladas com base ema sua densidade em sacarose, que tenha sido determinada empiricamente para ser semelhante a 1,2 M de sacarose.
Dependendo da causa biológica, fracções subcelulares podem ser separados por gradientes contínuos ou descontínuos de Percoll ou sacarose ou. Gradientes contínuos permitem a separação de proteínas em várias fracções; isto pode ser particularmente útil para demonstrar a co-localização de proteínas no interior de uma dada fracção 8. No entanto, a preparação de gradientes contínuos é mais trabalhoso e não é necessária para muitas aplicações. Gradientes descontínuos são comparativamente mais fáceis de preparar e pode ser usada para separar proteínas em algumas fracções, geralmente definidos. Gradientes descontínuos que são compostos por três camadas de aumento de sacarose molaridade têm sido amplamente utilizados para isolar as proteínas associadas com a membrana de plasma sináptico (SPM). Esta fracção de membrana de plasma sináptico pode ser ainda processado para a fractio densidade pós-sináptican (PSD) por tratamento com detergente e isolamento da fracção insolúvel em detergente.
Quando este processo foi descrito pela primeira vez na década de 1960 9,10, microscopia eletrônica foi utilizada para demonstrar as organelas e membranas que cerca definem a membrana plasmática sináptica e frações de densidade pós-sináptica 9-14. Estes estudos demonstraram a inclusão de membranas pré-e pós-sinápticos e vesículas sinápticas em fracção do SPM; após tratamento com detergente principalmente o elétron-denso, densidade pós-sináptica eram visíveis. No processo, um choque hipotónico é usado para comprimir fora os processos sinápticas do corpo da célula 10. Esta etapa leva vantagem de o facto de que as mitocôndrias são mais resistentes a choque osmótico e permanecem intactos, de modo que eles e sedimentam na parte inferior do gradiente de sacarose (Figura 1).
Usando a mesma técnica de enriquecimento, as frações de SPM e PSD foram os primeiros bioquimicamentedefinido por electroforese em gel de poliacrilamida e sequenciação dos principais componentes proteicos 15-17. Análise de mancha ocidental Subsequentemente foi usado para detectar e quantificar os níveis de proteínas sinápticas e ainda definir estas fracções (Figura 2). Nós temos usado essa técnica em nossos laboratórios para quantificar mudanças nos níveis sinápticos do transportador de dopamina que ocorrem quando o locus SLC6A3 é duplicada em camundongos 18. Também tenho usado essa técnica em receptores NMDA camundongos deficientes para descobrir reduções específicas de sinapse em proteínas que fazem parte da DISC1 interactome 19.
É evidente a partir da análise de Western blot que fracções SPM contêm proteínas de membrana de vesícula sináptica, marcadores endossoma, proteínas mitocondriais, enzimas associadas à membrana sintéticas e moléculas de transdução de sinal, bem como componentes integrais da densidade pós-sináptica e as membranas de plasma sinápticas 20-23. Efracções PSD ven pode ter contaminação com proteínas mitocondriais abundantes e pode ser necessário realizar um segundo gradiente de sedimentação ou de passos de purificação adicionais para removê-los 13. Recentemente, a espectrometria de massa quantitativo tem fornecido uma lista de mais de 100 proteínas na densidade pós-sináptica por si só, bem como uma indicação da abundância relativa destes componentes 24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem várias etapas do procedimento que são fundamentais para um bom resultado. No passo 3, é importante que um grau consistente de homogeneização é obtido para cada amostra. Quando homogeneizar o tecido com o homogeneizador accionado por motor, uma velocidade constante é utilizado não só para a rotação do pilão, mas também com o número de acidentes vasculares cerebrais. O tempo de incubação durante o choque osmótico deve ser mais preciso, uma vez que a homogeneização prolongada ou de incubação na…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).
Materials
| 1M HEPES, pH 7.4 | BioShop | HEP003.100 | |
| HEPES | BioShop | HEP001.500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507.1 | |
| EDTA | BioBasic | EB0185 | |
| PMSF | BioShop | PMS123.5 | |
| Aprotinin | BioShop | APR600.1 | |
| Leupeptin | BioShop | LEU001.1 | |
| Pepstatin | BioShop | PEP605.5 | |
| Benzamidine | BioShop | BEN601.25 | |
| Sodium fluoride | BioShop | SFL001.100 | |
| Sodium pyrophosphate | BioShop | SPP310.100 | |
| Sodium orthovanadate | BioShop | SOV664.10 | |
| β-glycerophosphate | BioShop | GYP001.10 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX506.500 | |
| 18G x 1 ½” needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog number | |
| Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 | VWR | KT885450-0023 | |
| IKA Model RW 16 Basic Stirrer | IKA Works | 2572100 | |
| Sorvall SM-24 Fixed Angle Rotor | ThermoScientific | 29017 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | ThermoScientific | 46910 | |
| Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL) | Beckman Coulter | 331372 | |
| SW 41 Ti Rotor Swinging Bucket | Beckman Coulter | 331362 | |
| Beckman L-80 Floor Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL) | Beckman Coulter | 349622 | |
| TLA-100.3 Fixed Angle Rotor | Beckman Coulter | 349481 | |
| Beckman TL-100 Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter |
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