컬렉션, 격리, 인간 자궁 경부 샘플의 유세포 분석
Summary
The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.
Abstract
Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.
Introduction
새로운 HIV 감염의 대부분은 전 세계적으로 여성은 2011 년 (UNAIDS 1) 새로운 감염의 47 %를 대표로, 이성애 전송을 통해 발생한다. 여성의 생식기 (FGT), HIV 및 기타 성병 병원체의 주 진입 포털 중 하나를 이해, 감염을 방지하기 위해 효과적인 전략을 찾는 경로에 높은 중요하다. 생식기 점막의 면역 반응은 분명히 독특하고 말초 혈액 2에서 측정 다릅니다. 그러나, FGT에서 면역 역학의 현재의 지식은 기껏해야 제한됩니다. 현재까지, 점막 면역 환경의 연구는 대부분이 감염 다음과 같은 점막 조직에서 초기 이벤트 이후 질병의 진행 3,4에 큰 영향을 미칠 것이 분명되고있다 창자 관련 림프 조직 (GALT)에 초점을 맞추고있다. 생식기 점막에서 샘플을 수집하는 것은 큰 도전을 나타내고 락 적어도 부분적으로 책임이있다FGT의 면역학의 이해 K. FGT이 로케일에서 샘플을 수집하고 분석하기위한 효율적인 방법을 필요로 한 독특한 환경의 맥락에서 호스트와 병원체의 면역 동적으로 퍼즐을 해결.
FGT는 두 개의 섹션으로 나누어 져 나팔관, 자궁 내막과 자궁 경부, 그리고 ectocervix을 포함하는 낮은 요로와 질을 포함하는 상부 생식기 (Kaushic 검토를 등 5). 그것은 서로 다른 사이트의 상대적 기여도는 HIV 감염에 무엇 아직 불분명하지만, 그것은 두 사이트 모두 HIV 항목 6에 기여할 수 있다고 믿고 있습니다. T 세포는 대 식세포가 (로드 리 게스 – 가르시아 검토 등 2) 약 10 %를 포함하는 동안, 상단과 하단의 생식 책자에서 백혈구 40 ~ 50 %를 차지한다. T 세포는 질, 경부, 자궁 내막 및 검출 할 수있다. 대 식세포는 더 강하게 locali 있습니다그들은 두 조직에서 검출 될 수 있지만, 자궁 경부보다 자궁 내막 및 자궁 근층 결합 조직에 제드 자형. 마지막으로, plasmacytoid 수지상 세포 (PDCS) 및 랑게르한스 세포는 또한 FGT 조직에서 검출 될 수있다. 표현형 및 면역 인구 및 HIV 감염에 감수성의 비율은 호르몬주기에 따라 중요하게 다를 수 있습니다, 호르몬 피임약, 세균성 질염이나 성적 활동 5,7-9의 사용.
다양한 방법 FGT의 면역 인구와 환경을 연구하기 위해 개발되었다. 자궁 경부 조직 검사, 자궁 및 자궁 경부 cytobrushes lavages (CVL) 10 ~ 12은 가장 일반적으로 문헌에서 사용할 수 있습니다. PBS의 세척에 의한 CVL 컬렉션은 간단한 방법이며, 매우 낮은 세포 수율 면역 조절 성 단백질 만, 결과의 연구를 허용하고, 따라서 FGT (13)의 면역 세포 집단을 공부에 적합하지 않습니다. CVL 샘플은, 반면에, 아르 V이러한 ELISA, 사이토킨 비드 어레이 (14) 또는 질량 분석 등의 방법 (15, 16)를 사용하여 각종 사이토킨, 케 모킨 또는 항균 인자의 발현을 측정함으로써 FGT의 면역 환경을 평가하기위한 유용한 ERY. 면역 세포 주파수, 표현형과 기능의 특성은 자궁 cytobrush 또는 자궁 경부 생검 표본 추출에 의해 자궁 경부 단핵 세포 (CMC)를 수집하여 달성 될 수있다.
자궁 경부 생검의 샘플링은 출혈의 불편과 위험을 증가와 여자 (12)의 면역 상태에 따라 절차에 따라 치료 2~11일 소요 침습적 방법이다. 한편, 자궁 cytobrushes는 수집 세포의 낮은 수율에도 불구하고, FGT로부터 면역 세포를 수집하기 위해 덜 침습적 더 편리한 방법이다. 두 가지 방법은 CD45 + 백혈구의 동일한 수율에 도달 할 수 있지만, 두 개의 연속 자궁 cytobrushes가 포함 된 세포의 동일한 금액을 얻기 위해 필요한 IN 한 생검 13. 그럼에도 불구하고, cytobrush 샘플링은 여전히 14 유동 세포 계측법에 의해 추가로 생체 표현형에 대한 세포의 수용 수 (약 5,000 CD45 + 세포 / cytobrush)를 제공합니다. 자극 세포 유세포 또는 qPCR에 HIV가 특정 면역 반응 (17) 또는 토륨 셀 (18)의 편광을 식별 cytobrush 유래의 CMC를 사용하여 수행되었다로서 또한 기능적인 특성은,이 샘플들에 수행 될 수있다. T 세포 인구의 팽창은 또한 CMC를 19으로 기능적 연구를 용이하게 할 수있다.
그것은 생검 및 cytobrushes는 FGT의 별개의 부분을 샘플링하는 것이 중요합니다. 자궁 cytobrushes은 자궁 경부와 아마 변환 영역의 상피 세포에서 파생 된 세포를 수집, 자궁 OS를 샘플링하면서 생검은 ectocervix (12, 13)의 상피 세포와 기질의 우수한 부분에서 파생됩니다. Cytobrush 샘플 따라서 재를 샘플링조직 검사는 편평 층상 상피 5 줄 지어 영역을 포함하는 동안 기온은 원주 상피 세포의 단일 층으로 구성. 그 결과, 자궁 경부 생검 및 cytobrush 의해 수집 백혈구 집단의 특성은 다르다. cytobrushes는 CD14 + 단핵 세포 / 대 식세포 (13)의 높은 비율의 컬렉션에 발생하는 반면 생검, CD3 + T 세포의 높은 비율을 수집합니다.
FGT의 면역학을 공부하는 것은 많은 년간 20 ~ 22에 대한 관심이었다 우리는 cytobrush 파생 CMC를 연구와 전문 지식의 큰 거래를 축적했다. 우리의 연구는 HIV에 감염된 감염되지 않은 및 HIV에 노출 된 혈청 음성 나이로비, 케냐 (HESN) 여성 성 노동자의 연구에 주로 초점을 맞추고있다. HIV는 우선적으로 FGT에 HIV 대상이 될 수있는 활성화 된 세포의 23 숫자가 낮아 HIV 취득에 대한 보호에 기여할 수있는 활성화 된 T 세포에 복제합니다. 이 가설 여러 스투과 일치에스 아직 감염되지 않은 24, 25을 유지하며,이 대기 표현형도 FGT 14에서 관찰되는 높은 HIV에 노출 된 HESN의 성 노동자들 사이 낮은 면역 활성화를 설명했다. 여기, 우리는 처리 방법을 설명하고 생체 유동 세포 계측법에 의해 자궁 경부 cytobrushes에서 파생 된 CMC 샘플에서 T 세포의 활성화를 평가.
Protocol
Representative Results
Discussion
여성의 생식기 (FGT)에서 내성에 대한 지식의 큰 격차를 감안할 때, CMC를의 표현형 분석은 자궁 경부에있는 다수의 림프구 집단에 대한 통찰력의 다양한 배열을 제공 할 수 있습니다. 프로테옴 분석 및 자궁 세척에서 바이러스 부하 측정과 함께, 성병 감염 (STI)의 다른 병원균에 대한 면역은 다양한 인구에서 해부 할 수 있습니다.
기술적 고려 사항 – CMC를가 : 분리 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Joshua Kimani, clinical director of the research program at the University of Nairobi, for his assistance with mucosal immunology studies related to this protocol. The authors would like to acknowledge funding from CHVI grant MOP 86721.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal Bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5ml tube ependroff | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation Buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
- . UNAIDS. Global Report 2013. http://www.unaids.org/en/media/unaids/contentassets/documents/epidemiology/2013/gr2013/UNAIDS_Global_Report_2013_en.pdf. , (2013).
- Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract. Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).
- Douek, D. HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut. Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).
- Hofer, U., Speck, R. F. Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection. Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).
- Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment. American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).
- Hladik, F., Hope, T. J. HIV infection of the genital mucosa in women. Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).
- Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus. Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).
- St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis. Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).
- Liebenberg, L. J., et al. Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract. Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).
- Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa. PloS one. 6, (2011).
- Hasselrot, K., et al. Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya. PloS one. 7, (2012).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, (2014).
- Lajoie, J., et al. A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers. Mucosal immunology. 5, (2012).
- Burgener, A., et al. Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers. Journal of proteome research. 10, (2011).
- Burgener, A., et al. A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression. Journal of virology. 87, (2013).
- Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional. Immunology. 139, (2013).
- McKinnon, L. R., et al. Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility. Journal of immunology. , (2011).
- Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract. Immunology. 130, 23-33 (2010).
- Iqbal, S. M., et al. Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers. The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).
- Hirbod, T., et al. Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women. Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).
- Horton, R. E., et al. A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells. PloS one. 4, (2009).
- Begaud, E., et al. Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans. Retrovirology. 3, 35 (2006).
- McLaren, P. J., et al. HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors. The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).
- Card, C. M., et al. Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence. PloS one. 7, (2012).
- Prodger, J. L., et al. Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status. Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).
- Reusch, L. M., et al. Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure. Journal of biomedical optics. 18, (2013).
- Oertelt-Prigione, S. Immunology and the menstrual cycle. Autoimmunity reviews. 11, (2012).
- Rahman, S., et al. Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders. American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).
