אוסף, בידוד, וניתוח תזרים cytometric של דוגמאות האנדוצרוויקאלית אדם

Summary

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Abstract

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

Introduction

רוב זיהומי HIV החדשים ברחבי העולם להתעורר באמצעות שידור הטרוסקסואלים, עם נשים המייצגות 47% מזיהומים חדשים ב2011 ⁽¹ UNAIDS). הבנה בדרכי המין הנשית (FGT), אחד מפורטלי הכניסה העיקריים ל-HIV ופתוגנים מועברים במגע מיני אחרים, הוא בעל חשיבות גבוהה בדרך למציאת אסטרטגיות יעילה למניעת זיהום. תגובה חיסונית ברירית איברי המין הם בבירור ייחודיות ושונים מאלו שנמדדו בדם היקפי ^2. עם זאת, ידע הנוכחי של הדינמיקה החיסונית בFGT מוגבל במקרה הטוב. עד כה, מחקרים של הסביבה החיסונית ברירית התמקדו בעיקר ברקמות הקשורים בטן הלימפה (גאלט), שבו התברר שיש לי האירועים המוקדמים ברקמות הריריות בעקבות זיהום השפעה חזקה על התקדמות מחלה לאחר ^3,4. איסוף דגימות מרירית איברי המין מהווה אתגר גדול ולפחות בחלקו אחראי לאקk הבנה של אימונולוגיה של FGT. פתרון החידה מהדינמיקה החיסונית בין המארח והפתוגן בהקשר של הסביבה ברורה שהיא FGT מחייב שיטות יעילה לאיסוף וניתוח של דגימות מאזור זה.

FGT מחולק לשני חלקים: מערכת הרבייה העליונה הכוללת חצוצרות, רירית הרחם וendocervix, ודרכים נמוכות יותר המכילה את ectocervix והנרתיק (נסקר על ידי Kaushic אח' ^5). זה עדיין לא ברור מה תרומתו היחסית של אתרים השונים אלה היא הידבקות ב-HIV, אבל הוא האמין כי שני האתרים יכולים לתרום לכניסת ה-HIV ^6. תאי T מייצגים 40-50% מleucocytes בקטעים העליונים ותחתונים הרבייה, ואילו מקרופאגים מהווים כ 10% (בדיקה ב-רודריגז גרסיה ואח' ^2). ניתן לאתר תאי T בנרתיק, צוואר הרחם, ורירית הרחם. המקרופאגים הם חזקים יותר localized ברירית הרחם ורקמת חיבור myometrial מצוואר הרחם, למרות שהם יכולים להיות מזוהים בשתי הרקמות. לבסוף, תאים הדנדריטים plasmacytoid (PDC) ותאים לנגרהנס יכולים גם להתגלות ברקמות FGT. הפנוטיפ והפרופורציות של אוכלוסיות חיסוניים והרגישות שלהם להידבקות ב-HIV עשויים להשתנות חשוב פי מחזורים הורמונליים, השימוש באמצעי מניעה הורמונליים, וגינוזיס חיידקים או פעילות מינית ^5,7-9.

מגוון שיטות פותחו כדי ללמוד את האוכלוסיות וסביבה חיסוניים של FGT. ביופסיה צוואר הרחם, צוואר הרחם וcytobrushes lavages הצרויקו (CVL) ^10-12 הם נפוץ ביותר על פני הספרות. CVL אוסף ידי שטיפת PBS הוא השיטה הפשוטה ומאפשר הלימוד של חלבוני ויסות מערכת החיסון, אך תוצאות בתשואה נמוכה מאוד של תאים, ולכן הוא אינו מתאים ללימוד אוכלוסיות תאים חיסוניים של FGT ^13. דגימות CVL הן, לעומת זאת, very שימושי להערכת הסביבה החיסונית של FGT ידי מדידת הביטוי של ציטוקינים שונים, כמוקינים או גורמים מיקרוביאלית באמצעות שיטות כגון ELISA, מערך חרוז ציטוקינים ¹⁴ או ספקטרומטריית מסת ^15,16. אפיון של תדרים חיסוניים תא, פנוטיפים ופונקציות יכול להיות מושגת על ידי איסוף תאים חד גרעיניים בצוואר הרחם (CMC) על ידי cytobrush צוואר הרחם או על ידי דגימת ביופסיה בצוואר הרחם.

דגימת ביופסיה צוואר הרחם היא שיטה פולשנית המגבירה את אי הנוחות וסיכון לדימום ולוקח 2-11 ימים כדי להחלים לאחר ההליך בהתאם למצב החיסונית של האישה ^12. מצד השני, cytobrushes צוואר הרחם, למרות התשואה נמוכה יותר של תאים שנאספו, היא שיטה פחות פולשנית ונוחה יותר לאיסוף תאים חיסוניים מFGT. שני שיטות יכולות להגיע לאותה תשואה של leucocytes CD45 +, אבל שתי cytobrushes צוואר הרחם רציף נחוצות כדי להשיג את אותה הכמות של תאים הכיל in ביופסיה אחת ^13. יחד עם זאת, דגימת cytobrush עדיין מספקת מספר מקובל של תאים (כ -5,000 CD45 + תאים / cytobrush) עבור vivo phenotyping נוסף לשעבר על ידי cytometry זרימה ^14. כמו כן, אפיון פונקציונלי יכול להתבצע על דגימות אלה, כגירוי וזרימת cytometry תאית או qPCR בוצעו באמצעות CMCs נגזר cytobrush לזהות תגובות HIV-ספציפיות חיסוניים ¹⁷ או ה תא קיטוב ^18. התרחבות של אוכלוסיית תאי T עשויה גם להקל על מחקרים פונקציונליים עם CMCs ^19.

חשוב לציין כי ביופסיות וcytobrushes לטעום מנות שונות של FGT. ביופסיות נגזרות מהחלק העליון של האפיתל ו stroma של ectocervix ^12,13, בעוד cytobrushes צוואר הרחם לדגום את מערכת ההפעלה בצוואר הרחם, איסוף תאים שמקורם האפיתל של endocervix ומן הסתם אזור טרנספורמציה. דגימות Cytobrush לכן לדגום מחדשגיון מורכב משכבה יחידה של אפיתל עמודים, בעוד ביופסיות, כוללות אזור בשורה של אפיתל מרובדת קשקש ^5. כתוצאה מכך, האופי של אוכלוסיות יקוציט שנאספו על ידי ביופסיה וcytobrush צוואר הרחם שונה. ביופסיות לאסוף שיעור גבוה יותר של תאי CD3 + T, ואילו cytobrushes לגרום לאוסף של שיעור גבוה יותר של מונוציטים CD14 + / מקרופאגים ^13.

לומד אימונולוגיה של FGT כבר עניין לשנים רבות ^ו20-22 שצברנו מומחיות רבה בחקר CMCs נגזר cytobrush. המחקרים שלנו מתמקדים בעיקר בלימוד seronegative HIV-נגוע, נגוע ונחשף ב-HIV (HESN) עובדי מין נשיים מניירובי, קניה. HIV משכפל מעדיף בתאי T מופעלים ²³ ונמוכות מספרים של תאים מופעלים שיכול להיות ממוקד על ידי HIV בFGT יכולים לתרום להגנה מפני רכישת ה-HIV. בקנה אחד עם השערה זו, כמה Studies תיאר הפעלה חיסונית נמוך יותר בקרב עובדי תעשיית מין HESN שנמצאים בחשיפה גבוהה לאיידס עדיין יישאר נגוע ^24,25, והפנוטיפ שקט זה נצפה גם בFGT ^14. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה לעיבוד והערכת הפעלת תאי T בדגימות CMC נגזרות מcytobrushes צוואר הרחם על ידי vivo לשעבר cytometry זרימה.

Protocol

שמירה על אתיקה: לוחות האתיקה המחקריות של שניהם מאוניברסיטת מניטובה וקניאטה הלאומית בית חולים / אוניברסיטת ניירובי אישרו מחקר זה וכתב הסכמה מהדעת התקבלה מכל משתתפי המחקר. 1. הכנת מדיה וCMC אוסף צינורות <li style…

Representative Results

זרימת multiparameter cytometry הוא כלי רב עוצמה כדי לנתח את פנוטיפים ופונקציות של תת תא ברקמות uncharacterized בעבר. ניתוח של דגימות CMC יכול להניב מידע על שני הלימפוציטים ואוכלוסיות מונוציטים עם אסטרטגיות gating מתאימות. אסטרטגית gating נציג CMC, בהשוואה ל…

Discussion

לאור פערים הגדולים בידע בנוגע לחסינות בדרכי המין הנשית (FGT), ניתוח פנוטיפי של CMCs יכול לספק מגוון רחב של תובנות אוכלוסיות לימפוציטים מרובות בצוואר הרחם. בשילוב עם ניתוח proteomic ומדידות עומס נגיפיים בשטיפת צוואר הרחם, חסינות לזיהומים המועברים במגע מיני (STI) של ופתוגנים אחר…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube	BD	352360	CMC processing
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	CMC processing
Fetal Bovine serum	Life technology	16000044	CMC processing
Fungizone	Life technology	15290-018	CMC processing
Penicillin/streptomycin	Sigma	P4333-20ml	CMC processing
50ml Falcon tube	Fisher	14-959-49A	CMC processing
Blood Bank disposable transfer pipette	Fisher	13-711-6M	CMC processing
Cytobrush plus	Cooper surgical	C0121	CMC sampling
Disposable cervical scraper	Quick medical	2183	CMC sampling
15 ml Falcon tube	Fisher	14-959-70c	CVL processsing
1.5ml tube ependroff	Fisher	05-402-18	CVL storage
LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit	Invitrogen	Various	Flow cytometry reagent
Fixation Buffer (4% PFA)	BD	554655	Flow cytometry regeant
IgG mouse	Sigma	I8765	Flow cytometry regeant