Introduction
Большинство новых случаев ВИЧ-инфекции во всем мире возникают в результате гетеросексуальных контактов, при этом женщины, представляющая 47% новых случаев инфицирования в 2011 году (ЮНЭЙДС 1). Понимание женский генитальный тракт (Fgt), один из главных порталов входа для ВИЧ и других инфекций, передающихся половым путем, имеет большое значение на пути к поиску эффективных стратегий для предотвращения инфекции. Иммунный ответ на слизистой оболочки половых органов, очевидно, уникальным и отличаться от тех, измеренный в периферической крови 2. Однако современные знания иммунных динамики на FGT ограничивается в лучшем случае. На сегодняшний день исследования слизистой иммунной среде в значительной степени сосредоточена на кишечником лимфоидной ткани (Галт), где стало ясно, что ранние события в слизистые ткани следующие инфекции оказывают сильное влияние на последующее прогрессирования заболевания 3,4. Сбор образцов из слизистой оболочки половых органов представляет собой серьезную проблему, и по меньшей мере частично ответственным за LacК от понимания иммунологии FGT. Решение головоломки иммунной динамике между организмом хозяина и возбудителем в контексте отдельной среде, FGT требует эффективных методов сбора и анализа образцов из этой местности.
FGT делится на две части: верхняя репродуктивного тракта, что включает в себя маточные трубы, эндометрий и канала шейки матки, а нижний тракт, который содержит Ectocervix и влагалище (обзор Kaushic др. 5). До сих пор неясно, что относительный вклад этих различных сайтов к ВИЧ-инфекции, но считается, что оба сайта может способствовать проникновения ВИЧ 6. Т-клетки представляют 40-50% лейкоцитов в верхних и нижних половых путей, в то время как макрофаги содержат приблизительно 10% (обзор в Rodriguez-Garcia и др. 2). Т-клетки могут быть обнаружены в влагалища, шейки матки и матки. Макрофаги сильнее Localiзет в эндометрии и соединительной ткани миометрия, чем шейки матки, хотя они могут быть обнаружены в обеих тканях. Наконец, плазмацитоидных дендритные клетки (ЦПК) и клетки Лангерганса также могут быть обнаружены в НАШИ АДРЕСА тканей. Фенотип и пропорции иммунных населения и их восприимчивости к ВИЧ-инфекции может варьироваться главное соответствии с гормональными циклами, использование гормональных контрацептивов, бактериального вагиноза или сексуальные действия 5,7-9.
Разнообразные методы были разработаны для изучения иммунной населения и окружающей среды FGT. Рак шейки биопсия, шейные cytobrushes и цервиковагинальная орошений (ЛПМ) 10-12 являются наиболее часто используется во литературе. Коллекция ЛПМ на PBS промывания является самым простым методом и позволяет изучение иммунных модуляторных белков, но приводит к чрезвычайно низким выходом клеток, и поэтому не подходит для изучения популяций иммунных клеток на FGT 13. Образцы масел и АКБ являются, с другой стороны, обERy полезен для оценки иммунного среду FGT путем измерения экспрессии различных цитокинов, хемокинов или антимикробных факторов с использованием методов, таких как ELISA, цитокин борта массива 14 или масс-спектрометрии 15,16. Характеристика частот иммунных клеток, фенотипов и функций может быть достигнуто путем сбора мононуклеарных клеток шейки матки (CMC) шейки щеточкой Cytobrush или путем отбора проб биопсией шейки матки.
Выборки шейки биопсия инвазивный метод, который увеличивает дискомфорт и риск кровотечения и занимает от 2 до 11 дней, чтобы залечить после процедуры в зависимости от иммунного статуса женщины 12. С другой стороны, рак шейки cytobrushes, несмотря на более низкий выход клеток, собранных, является менее инвазивным и более удобный способ для сбора иммунных клеток из FGT. Оба метода могут достичь такого же выход CD45 + лейкоцитов, но два последовательных шейки cytobrushes необходимы для получения такого же количества клеток, содержащихся ян один биопсия 13. Тем не менее, отбор проб цитощеточка еще обеспечивает приемлемый количество клеток (около 5000 CD45 + клеток / цитощеточка) для дополнительной экс естественных фенотипирования с помощью проточной цитометрии 14. Кроме того, функциональные характеристики можно проводить на этих образцах, как стимулирование и внутриклеточный проточной цитометрии или КПЦР были выполнены с использованием цитощеточка полученных КМЦ, чтобы определить ВИЧ-специфические иммунные реакции 17 или Th клеток поляризацию 18. Расширение клеток населения T может также облегчить функциональные исследования с ОМЦ 19.
Важно отметить, что биопсии и cytobrushes образец различных частей FGT. Биопсии получены из верхней части эпителия и стромы Ectocervix 12,13, в то время шейки cytobrushes пробовать шейки матки, сбор клеток, полученных из эпителия канала шейки матки и, предположительно зоны трансформации. Следовательно, с образцами цитощеточка попробовать повторноГион состоит из одного слоя цилиндрического эпителия, в то время биопсии, включать область выстлана плоскоклеточный многослойного эпителия 5. В результате, природа популяций лейкоцитов, собранных цервикальной биопсии и щеточкой Cytobrush отличается. Биопсия собрать более высокую долю CD3 + Т-клеток, в то время как cytobrushes привести к коллекции более высокая доля CD14 + моноциты / макрофаги 13.
Изучение иммунологии FGT был интерес на протяжении многих лет 20-22, и мы накопили огромный опыт с изучением цитощеточка полученных СМС. Наши исследования сосредоточены в основном на изучении ВИЧ-инфицированных, неинфицированных и ВИЧ-инфицированными серонегативных (HESN) работница секс от Найроби, Кения. ВИЧ преимущественно размножается в активированных Т-клеток 23 и меньшее число активированных клеток, которые могут быть мишенью ВИЧ в FGT могли бы способствовать защите от заражения ВИЧ. В соответствии с этой гипотезой, несколько Studiэс описали низкую иммунную активацию среди HESN работников секс-бизнеса, которые подвергаются высокому ВИЧ еще остаются неинфицированных 24,25, и это в состоянии покоя фенотип наблюдается также в FGT 14. Здесь мы описываем методологию для обработки и оценки Т-клеток активации в образцах CMC, полученных из шейки матки cytobrushes экс естественных проточной цитометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление этика: по этике научных исследований доски как в Университете Манитобы и Кениата Национальной больницы / Университет Найроби одобрил это исследование и письменное информированное согласие было получено от всех участников исследования.
1. Подготовка информации и КМЦ Коллекция Трубы
- Подготовка забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) (137.93 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 8,1 мМ Na 2 HPO 4, 1,47 мМ KH 2 PO 4). Автоклав на стерильность. Это может храниться при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев.
- Предварительно Аликвота 5 мл PBS в 50 мл трубки сокола (по одному на образце должны быть собраны) и хранить при температуре 4 ° С до времени отбора проб.
- Этикетка 2-4 криопробирки или 1,5 мл микроцентрифужных пробирок на образец для сбора промывание для хранения.
- Подготовка культуральной среды клеток: RPMI 1640 + 1% пенициллин / стрептомицин / амфотерицин В (конечная концентрация 100 единиц / мл, 100 мкг / мл и 250 нг / мл, respectivелы, без FCS / FBS добавил.
2. Сбор цитощеточка образцов
Сбор образцов цитощеточка является неинвазивная процедура, которая должна быть выполнена квалифицированным MD или гинекологу.
- Сбор шейки мононуклеарных клеток (КМЦ) с использованием как цитощеточка и деревянным или пластмассовым скребком. Сбор CMC от участника под зеркалах экспертизы, вставив скребок и вращающихся вокруг шейки матки (рис. 1). Вставьте цитощеточка в эндоцервикальных ОС, повернуть на 360 °, и сразу же разместить как цитощеточка и скребок в 50 мл трубки сокола, содержащей 5 мл PBS.
- Держите образцы на льду / на 4 º C до обработки. Для поддержания жизнеспособности клеток, образцы процесса в пределах 2 часов сбора.
- Если это возможно, собирать соответствующих образцов крови в зеленых лучших vacutainers гепарина для мононуклеаров периферической крови клетки (РВМС) изоляции в качестве компаратора / контроля для анализа CMC.
3. Выделение ОМЦ
Выполните обработку образца в уровень биологической безопасности 2 лаборатории, в стерильной камере биобезопасности с двойными перчатками.
- Во время сбора, образцы CMC может быть загрязнены кровью. Исключить образцы с видимой контаминации крови из исследования, чтобы предотвратить включение сбивающий РВМС в конечном образце. В связи с низким числом лимфоцитов, выделенных из CMC, незначительные загрязнения крови может легко сокрушить компонент лимфоцитов CMC.
- Vortex сокол пробирки, содержащие как цитощеточка и скребок для 45 сек отделить клетки от щеток. Образцы могут стать пенистый в ходе этого процесса; это нормально.
- Используйте цитощеточка, чтобы очистить все оставшиеся материалы от скребка, и выбросьте скребок в раствор отбеливателя. Для сбора любых клеток остаются прикрепленными к кисти / скребком, использовать новый перчатку выжать скребок между большим и указательным пальцами.Скатитесь щетку, позволяя клеткам и PBS быть собраны в одной 50 мл пробирку. Откажитесь от цитощеточка в раствор отбеливателя, и выбросить перчатку.
ВАЖНО: Используйте новую перчатку для каждого образца. - Установите 100 мкм фильтр нейлон клеток к свежим 50 мл трубки сокола. Использование передачи пипетки, собирать PBS-клеточной суспензии из пробирки и процеживают через сито в чистую пробирку.
- Добавить 5 мл RPMI 1640 с первоначальным пробирку. Использование передачи пипетки, мыть стороны пробирку с RPMI, и передать через фильтр на новый пробирку. Промыть нижнюю часть нейлоновый фильтр с RPMI, а также.
- Центрифуга образцов для 10 мин при 514 х г. Очень важно, чтобы оставить центрифуги тормоз с на этом этапе, с тем чтобы предотвратить оплывание гранул CMC.
- Осторожно удалите супернатант из трубы, заботясь, чтобы не беспокоить гранул. Размер гранул будет сильно варьирует; в такмне образцы, осадок довольно большой из-за наличия большого числа эпителиальных клеток, в то время как в других случаях, осадок едва заметны и высокой прозрачностью.
- Ресуспендируют гранул нежным агитации трубки сокола. Добавить 5 мл PBS мыть образец.
- Центрифуга снова в течение 10 мин при 514 х г, без центрифуги тормоза.
- Осторожно отбросить супернатант и вновь приостановить гранул, как описано выше. Клетки готовы к любой криоконсервации (с использованием протокола криоконсервации РВМС), стимуляции или проточной цитометрии фенотипирования.
4. Поверхность CMC Окрашивание и проточной цитометрии
- Ресуспендируют гранул с шагом 3,10 в 100 мкл блокирующего раствора и передать либо в 96-луночный планшет или FACS трубы. Блокирующего раствора (блокировать рецепторы Fcγ) рецепт следующим образом: 1,8 мкл IgG мыши (конечная концентрация 0,2 мкг / мкл), 5 мкл FBS и 93,2 мкл FACS мыть (PBS + 2% FBS).Окрашивание может быть выполнена в 96-луночный планшет, если размеры гранул достаточно малы, но, возможно, должны быть выполнены в FACS труб, если гранулы обычно велико. Важно, чтобы титровать антител соответственно.
- Блок образцы в течение 10 мин на льду / при 4 ° С.
- Промывают клетки 100 мкл FACS Wash (PBS + 2% FBS) в 96-луночных планшетах, или 500 мкл FACS в трубах. Центрифуга при 600 мкг в течение 10 мин при 4 ° С с тормозом низкий (или выключить, если низкий Установка тормоза недоступен).
- Удалить супернатант и повторно приостанавливать осадок клеток при перемешивании. Добавить жизнеспособность Пятно (Живые Мертвые поправимо жизнеспособность красителя). Подготовка жизнеспособность красителя в соответствии с инструкциями изготовителя. Это, возможно, должны быть титрованию для использования в каждой лабораторной установке / цитометра. Выдержите в течение 30 мин в темноте при 4 ° С.
- Вымойте клетки 100 μl/500 мкл PBS (для 96-луночных труб пластина / FACS). Центрифуга при 600 мкг в течение 10 мин с низким / без тормозов. Удалить supernatanт и ресуспендирования клеток.
- Инкубируйте клетки с коктейлем поверхностных маркеров антител, в общем объеме 100 мкл. ВАЖНО: Оптимизация и титруют каждый проточной цитометрии панели предварительного попробовать окрашивание. Инкубируйте клетки в течение 30 мин в темноте при 4 ° С.
- Повторите шаг 4,5. если окрашивание в 96-луночный планшет, передача клеток в FACS трубы и разбавьте до конечного объема 750 мкл FACS краска, которая содержит 1% параформальдегида (PFA) (или Cytofix, разбавленный 1 в 4). Перейдите к сбора данных на цитометром потока.
5. Сбор и подготовка шейки промывания влагалища (ЛПМ)
- До цитощеточка выборки, использовать шприц для мытья канала шейки матки с 2 мл стерильной PBS и аспирации промывание от заднем своде.
- Соберите атмосферный образец промывание в 15 мл трубки сокола и не держать на льду / на 4 º C до обработки.
- Центрифуга образца при 400 х г в течение 7 минут дл удалени клеточного дебриса.
- Колорадоllect супернатанта аликвоту образца в 1 мл или 500 мкл аликвоты и хранят при -70 ° С. Аликвоты можно разморозить для ELISA или анализа шарик массива CVL белков, но избежать многократного замораживания / оттаивания.
- При желании ресуспендируют осадок из клеточных остатков в РНК Позже для измерения экспрессии РНК, следуя протоколу производителя.
6. Сбора данных
- Подготовить набор компенсационных труб, соответствующий панель антител. Запуск компенсации трубки для регулировки спектрального перекрытия. Запустите образцы на любой потока многоцветной цитометра, настроенный для флуорохромом сопряженных антител, используемых в панели.
- Приобретать образец РВМС сначала отрегулировать рассеяния вперед (FSC) и бокового рассеяния напряжения (SSC) в целях выявления популяции лимфоцитов. Старайтесь держать их на 100 на каждой оси в линейном масштабе. Запуск контроль РВМС сделает его значительно легче найти популяции лимфоцитов CMC.
- Порог FSC для образцов CMC может потребоваться увеличение относительно образцов РВМС из-за намазать вверх по оси SSC при низких значениях FSC.
- Vortex каждую пробирку до приобретения. Приобретать всю трубу, чтобы максимально увеличить количество лимфоцитов ворот событий, собранных. Тщательно следить за машиной, чтобы избежать засорения.
- Экспорт данных в программу анализа проточной цитометрии, таких как FlowJo.
7. Память Стратегии
- Выберите передней стороне разброс высокий (FSC-H) / Вперед площадь боковой разброс (FSC-А), чтобы определить, население синглетный.
- Выберите Время против флуоресцентный маркер (как, например, FITC) для контроля за качество приобретения. Изменение скорости потока может ввести артефактов в данных. Исключить любую область, которая показывает расхождение в скорости потока.
- Определить популяции лимфоцитов на SSC-A/FSC-A участка. Используйте контроль РВМС для облегчения идентификации. Обратите внимание, что население лимфоцитов CMC может быть не так ясно, как контроль РВМС. </ Li>
- Ворота на SSC-A/viability красить, чтобы исключить мертвые клетки с живыми клетками. Мертвые клетки могут неспецифически включать антитела, которые будут вводить артефакты.
- Ворота на SSC-A/CD3 идентифицировать популяции клеток T. Из этих ворот, определить группы населения, CD4 + и CD8 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мультипараметрический проточной цитометрии является мощным инструментом рассекать фенотипы и функции клеточных подмножеств в ранее неохарактеризованных тканей. Анализ проб CMC может дать информацию как лимфоцитов и моноцитов населения с соответствующих стратегий селекции.
Представитель CMC стратегия стробирования, по сравнению с согласованной профиль РВМС, показан на рисунке 2. FSC-против FSC-H участка позволяет исключить клеточных дублетов, которые широко распространены в образцах по сравнению с CMC РВМС, даже после фильтрации (рис. 2а). Контроль качества включает в себя удаление вопросов потока по стробирования на время, где изменения в скорости потока или артефактов из-за выборочных сгустки могут быть легко идентифицированы (рис. 2б). Идентификация населения лимфоцитов / моноцитов относительно сходным в РВМС и образцов CMC (рис. 2В). Исключение мертвых клеток на жизнеспособность красителя предотвращает включениеиз апоптоза клетки, которые неспецифически принятые до флуоресцентные конъюгаты антител. Жизнеспособность ниже в образцах CMC сравнению с РВМС, и может быть сильно варьируется от образца к образцу (рис. 2б).
Этот анализ будет сосредоточена на фенотипирование население Т-лимфоцитов, но образцы CMC также содержат моноциты. После стробирования на популяции моноцитов, клетки закрытого на основе красителя и жизнеспособности канала сброса (фиг.3А). Канал дампа содержит антитела против CD56, CD3 и CD19, и стробирования на самосвалы канала-негативных клеток устранит любые загрязнения лимфоцитов в популяции моноцитов. Клетки затем могут быть определены на основе экспрессии маркеров, таких как CD16 и CD11c. Популяции лимфоцитов CD3 +, как правило, уменьшается пропорционально между КМЦ по сравнению с РВМС (фиг.3В, таблица 1). Высокая доля эпителиальных клеток, гранулоцитов и не CD45 + лейкоцитов CD3 +, содержащихся в образцах CMC гominates более клеточной популяции T. CD4 + T-клетки (медиана: 55.30%, МКР: 50.53% -68,18%) и CD8 + Т-клетки (медиана: 25,60%, МКР: 21,50% -33,80%) находятся на более низком соотношении (ближе к 2:01 среди CMC) по сравнению с 5:1 наблюдается среди здоровых образцов РВМС от коммерческой секс-работников когорты в Кении (рис. 3C, Таблица 1). Как и в крови, ВИЧ-инфекции влияет на пропорции CD4 + и CD8 + Т-клеток среди CMC, уменьшение CD4 +: CD8 + до 0,7 (медиана: 0,7, IQR: 0.31-2.45) (Фигура 3С, таблица 1). Тем не менее, это не редкость наблюдать более высокую пропорцию CD8 + Т-клеток среди населения CMC от здоровых людей (фиг.3С). Интересно, расширенный CD4-CD8-(двойное отрицание, DN) Т-клеток населения по сравнению с РВМС DN T частоты клеток можно наблюдать среди многих образцов CMC ВИЧ-отрицательных лиц (табл. 1). Эти результаты аналогичны результатам, полученным для образцов крайней плоти 26, AlthoУф эти клетки плохо охарактеризованы.
Типичные маркеры Т-клеток фенотипические легко количественно среди ОМЦ но могут отличаться от МНПК; Рисунок 4 демонстрирует идентификацию + CD161 + + (MAIT) населения CD8, который отличается в МНПК но почти отсутствует в ОМЦ (рис. 4А). Выражение активации маркеров CD69 и HLA DR, миграция маркер CCR5 или истощение маркеров PD-1 могут быть четко определены на CD4 + или CD8 + популяций (рис. 4В).
Количественное определение концентрации цитокинов / хемокинов в CVL могут быть проанализированы параллельно с окрашиванием CMC. Это позволяет корреляции между цитокинов среде ЛПМ (провоспалительный против иммунорегуляторных) и фенотипа ОМЦ. Эти данные также могут быть использованы для определения, является ли частота экспрессии рецептора хемокина на КМЦ связана с относительной экспрессии любой из плазмы или CVL хемокинов 14. Таблица 2 </ STRONG> указывает на среднюю концентрацию цитокинов и хемокинов анализируемых в ЛПМ, собранных от здоровых женщин и испытываемых комплектов Milliplex цитокинов шарик массива.
Рисунок 1. Анатомия женского репродуктивного тракта. А) вид в разрезе женского репродуктивного тракта, с указанием взаимосвязи влагалища к наружного зева шейки матки, цервикального канала и полости матки. Б) Вид спереди угол шейки матки, показывая наружного зева и переднего и заднего свода регионы в 12:00 и 6:00 соответственно. Воспроизводится с разрешения Reusch др. 27. Шейный скребок вращается вокруг шейки матки, чтобы собрать CMC, а цитощеточка вставляется в канал шейки матки и вращается для сбора дополнительной CMC. Шейки вагинальные орошений (ЛПМ)собирают путем промывания канала шейки матки с PBS и собирают его из заднего свода.
Рисунок 2. Стробирования и контроля качества образцов CMC. А) Идентификация синглетов по FSC-A по сравнению с FSC-H участке демонстрирует низкий процент синглетов в образцах CMC сравнению с образцами РВМС, даже после фильтра на основе КМЦ изоляции. B) Примеры высоких и бедными образцов качества показаны для нескольких качества шаги управления. Стробирование Время против флуоресценции (или SSC / FSC) может выявить проблемы расхода и использоваться для исключения событий, которые могут привести к окрашивания артефактов. Популяции лимфоцитов на основе ФСБ против SSC может или не может быть легко идентифицированы в зависимости от образца. Включение жизнеспособность красителя имеет решающее значение, так как некоторые образцы могут содержать менее 50% жизнеспособных клеток. Viabiliти (амин-реактивный) красители окрашивают мертвые клетки ярче живых клеток, как потеря целостности мембраны на клеточной гибели позволяет краситель для доступа аминогруппы на белков внутри клетки. Жизнеспособные клетки поэтому определены путем стробирования на популяции жизнеспособности красителем отрицательным.
Рисунок 3. Идентификация Т-клеток подмножеств. А) CD3 + населения среди образцов CMC, как правило, меньшая доля ворот лимфоцитов по сравнению с образцами РВМС. Образцы CMC также более переменной в размер популяции клеток T, как показано ниже. B) CD4 +, CD8 + и CD4-популяции CD8-Т-клеток легко идентифицируются как в КМЦ и образцов РВМС. CD4: CD8 Т-клеток может изменяться от образца к образцу среди КМЦ, как показано. Данные, приведенные была собрана из инфицированных ВИЧ женщин.
Рисунок 4. Клеток фенотипы Т в образцах CMC. А) слизистой оболочки связаны инвариантные Т-клетки (MAIT) CD8 + CD161 + + население, которое легко идентифицируется в образцах РВМС почти полностью отсутствует в ОМЦ. В CD8 + CD161 + Т-клетки могут быть идентифицированы в обоих образцах. Б) ОМЦ экспонат выражение фенотипических маркеров, включая CD69, HLA DR, CCR5 и PD-1. Гейтс были сделаны на основе флуоресценции минус один (FMO) управления. Данные, приведенные была собрана из инфицированных ВИЧ женщин.
| ОМЦ | МНПК | |||||
| Население | ВИЧ + (п = 34) | ВИЧ-(п = 44) | P значение | ВИЧ + (п = 28) | ВИЧ-(п = 35) | P значение |
| медиана (МКР) | медиана (МКР) | медиана (МКР) | медиана (МКР) | |||
| % Текущие лимфоциты | 85,65 (60.25-92.63) | 88,70 (74.85-95.38) | 0.1193 | - | - | |
| % CD3 + в живом ворот лимфоцитов | 5.94 (0.90-16.80) | 1.44 (0.39-8.46) | 0.0303 | 41,15 (17.08-62.10) | 41,90 (20.40-51.30) | 0,4231 |
| Значение р б | <0,0001 | <0,0001 | ||||
| % CD8 + в CD3 + ворота | 43,20 (25.75-66.00) | 25,60 (21.50-33.80) | 0.001 | 30,05 (22.75-38.78) | 14,60 (8.01-24.80) | <0,0001 |
| Значение р б | 0.0291 | <0.0001 | ||||
| % CD4 + в CD3 + ворота | 31.10 (20.45-63.10) | 55,30 (50.53-68.18) | 0.0003 | 56,10 (50.10-61.28) | 77,20 (65.90-92.80) | <0,0001 |
| Значение р б | 0.002 | <0,0001 | ||||
| Соотношение CD4: CD8 | 0.71 (0.31-2.45) | 2.09 (1.55-3.01) | 0.0003 | 1,92 (1.44-2.39) | 5.34 (2.66-10.77) | <0,0001 |
| Значение р б | 0.004 | <0,0001 | ||||
| % DN в CD3 + ворота | 10.40 (6.36-14.30) | 10,70 (6.76-19.10) | 0,4793 | 9.58 (6.65-15.98) | 7.01 (5.26-8.07) | 0,0032 |
Значение р | 0.8338 | 0.0006 | | ||||
Таблица 1. Относительные количества Т-клеток подмножеств в ОМЦ и МНПК. CMCsamples от 44 ВИЧ-отрицательных и 34 ВИЧ-инфицированных женщин секс и образцов РВМС от 35 ВИЧ-отрицательных и 28 ВИЧ-положительные сравнивали по их относительной доли живых клеток, CD3 + Т-клетки и CD4 +, CD8 + и CD8-CD4-DN Т-клеточные подмножеств. Данные представлены в виде медианы (25-й -75 й межквартильный IQR). Различия между группами были рассчитаны с помощью теста Манна-Уитни. р значения указывают на исход сравнения между ВИЧ + и ВИЧ-или В КМЦ и РВМС данных.
| Аналит | Понимать (стандартное отклонение). | |
| пг / мл | пг / мл | |
| MIP-3a | 35.5 (90.6) | 2.9 |
| МИГ | 1447 (3026) | 19.4 |
| МКДЛ | 2.7 (6.3) | 0.8 |
| Фракталкин | 51.6 (69.5) | 10.6 |
| IFN-a2 | 24.0 (12.0) | 40.6 |
| ИФН-г | 3,9 (14,2) | 0.3 | Ил-1a | 268,4 (721,3) | 6.4 |
| Ил-1b | 46,8 (126,2) | 0.7 |
| Ил-1ra | 4967,0 (3597) | 5.5 |
| IL-2 | 0,9 (2,6) | 0,6 |
| IL-6 | 14.8 (30.5) | 0.7 |
| IL-7 | 6,3 (10.1) | 0.1 |
| ИЛ-8 | 1491 (2126) | 0.3 |
| 4.5 (8.6) | 0.5 | |
| ИЛ-15 | 1.4 (2.7) | 0.7 |
| IL-17 | 1.1 (2.2) | 0.3 |
| IP-10 | 381,4 (1100) | 2.2 |
| МСР-1 | 129,4 (340,4) | 1.6 |
| МСР-3 | 5.9 (7.1) | 3.7 |
| MDC | 84.2 (94.6) | 6.9 |
| MIP-1a 20.9 (28.9) | 6.4 | |
| MIP-1b | 28.5 (42.6) | 8.9 |
| sCD40L | 10.8 (19.3) | 9 |
| Sil-2RA | 8.4 (9.8) | 7.7 |
| TNF- | 1,9 (4,1) | 0.1 |
Таблица 2. Экспрессия цитокинов и хемокинов в ЛПМ. Образцы из 51 инфицированных ВИЧ (не HESN) участников женского секс-работников когорты в середине менструального цикла, были исследованы на концентрации цитокинов / хемокинов помощью Milliplex MAP человека цитокинов / хемокинов шарик Комплект массив по словам производителя'Ы в одночасье протокол, в дубликатах. ИФН: интерферон; MCP: хемотаксиса моноцитов белок; MDC: макрофагов, полученные хемокинов, с: растворим; TNF: фактор некроза опухолей; MIP: макрофагов воспалительный белок; МКДЛ: интерферон inductible Т-клеток альфа хемоаттрактант; МИГ: монокин индуцируется гамма-интерферона; IP-10; интерферон inductible белка. через Значения ниже предела обнаружения были присваивается значение половины предела обнаружения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С учетом больших пробелов в знаниях в отношении иммунитета в женских половых путей (ФГТ), фенотипическая анализ ОМЦ может обеспечить широкий спектр идеи на несколько популяций лимфоцитов на шейке матки. В сочетании с протеомного анализа и измерений вирусной нагрузки в шейном промывания, иммунитет к инфекциям, передающимся половым путем (ИППП) с и других патогенов можно разрезать в различных популяциях.
Технические аспекты - ОМЦ: Выделение и успешным окрашивание образцов CMC может оказаться непростой задачей. Оптимизация протокола сбора CMC подчеркнул эффективность сбора CVL первым, а затем шейного скребком, а затем, наконец, цитощеточка. Важно, чтобы увеличить плановые объемы выборки по сравнению с рассчитанными для периферийных исследований крови в связи с увеличением вероятности образца исключения для целого ряда причин, обсуждаемых ниже.
Тестирование желаниемПанель D поток на образцах CMC имеет решающее значение перед начала исследования. Важно контролировать сотовый аутофлюоресценция в образцах CMC, особенно в моноцитов ворот. CMC аутофлюоресценция в некоторых каналов может быть повышен по сравнению с МПК, которые могут повлиять на стробирования и сигнал-шум. Кроме того, оптимальные напряжения должны быть подтверждены для образцов CMC если ранее определяется на образцах РВМС.
Для сохранения целостности данных, важно, чтобы исключить образцы с загрязнением крови или смешивая ИППП. Включение жизнеспособности клеток красителя в проточной цитометрии панели является жизненно важным, чтобы исключить мертвые клетки, которые неспецифически занимают флуоресцентных антител. В то время как большинство образцов весьма жизнеспособным, это не редкость, чтобы исключить 10-20% клеток жизнеспособность красителя. Если подмножество анализ, основанный на CD4 и CD8 экспрессии планируется, важно, чтобы получить по крайней мере 100 CD3 + события приступить к анализу. Образцы, собранные от разных женщин, и даже из того же девушка т различные моменты времени, может дать совершенно разных номера сотового 13.
Цитометрический анализ в потоке слизистой лимфоцитов часто легче и более успешным, если контрольный образец РВМС может работать одновременно с образцами CMC. В некоторых образцах CMC, население лимфоцитов трудно определить по FSC / SSC стробирования, но включение образца РВМС даст лучшее представление о том, где ворота. Даже в образцах без четкой лимфоцитов FSC / SSC населения, отличается CD3 + популяции могут быть идентифицированы. Если бы приобретение данных прерывается технических вопросов (цитометр впускного засорения, пузыри и т.д.) стробирования на флуоресценции с течением времени может удалить артефакты сбора данных, все еще позволяя анализа проб. Соответствующие управления, такие как флуоресценции минус один (FMO) труб для размещения затвора возможно, должны быть выполнены на мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), когда число клеток, необходимых слишком существенной, чтобы использовать образцы цитощеточка.
ontent "> Несколько исследований продемонстрировали обнаружение антиген-специфических ответов Т-клеток среди образцов CMC. CMC продукции цитокинов также может быть индуцирован РМА / Ionomycine, PHA, IFN-и анти-CD3 стимуляция. Одним из основных ограничений CMC стимуляции является количество клеток, уменьшает количество условий и управления, которые могут быть выполнены по образцу. Важно также внимательно следить и принимаем дополнительные меры по предотвращению загрязнения клеточной культуре. половых путей не является стерильным сайт, а в некоторых случаях дополнительные антибиотики должны быть добавлены в культуральную среду для предотвращения бактериального роста. Хотя КМЦ может быть криоконсервации с небольшой потерей жизнеспособности, восстановление примерно на 50%, что делает криоконсервированных образцы бедных кандидатов для стимуляции исследований, если расширение клеток не планируется 10.Технические аспекты - ЛПМ: Сборник ЛПМ обычно приводит к ограниченной выборки обобъема, предотвращая анализ большого числа концентрации белка путем многократного ELISA. Альтернативный анализ является шарик массив цитокин, основанный на платформе Luminex или платформы проточной цитометрии. Мультиплексные комплекты доступны от нескольких коммерческих источников, что позволяет для количественной оценки до 30 анализируемых в крайне малом объеме выборки (часто ~ 25 мкл). Оптимизация этих анализов показали, Оптимальное обнаружение аналитов с использованием протокола инкубации в течение ночи. Некоторые анализируемые, которые поддающийся обнаружению в образцах плазмы / сыворотки не поддающийся обнаружению в ЛПМ. Следует отметить, что концентрация образцов CVL с использованием центрифужных колонок не улучшить обнаружение любых аналитов, предполагая, что нет никакой выгоды в концентрации образца до запуска шарик массива анализа.
Вмешивающиеся факторы, характерные для слизистой оболочки половых органов: изучение ФГТ иммунологии должны заботиться, чтобы признать и учесть, как много вмешивающиеся переменные, как это возможно. Менструальный цикл чкак теперь было показано, влияют на периферическую невосприимчивость крови 28, и, вероятно, оказывает большее воздействие на CMC фенотипа и клеточного состава, а также белки, полученные от образцов CVL 29. Синхронизация сбор образцов для фазы менструального цикла цикла является предпочтительным способом снижения изменчивости данных, будь измерено уровнями эстрогена / прогестерона или дней с первого дня последней менструации. Использование гормональной контрацепции также оказывает большое влияние на окружающую среду слизистой оболочки и ее влияние должно быть принято во внимание при разработке или анализе исследование. Изменение флоры влагалища приводит к бактериального вагиноза (БВ) также изменяет иммунную среду и клеточные фенотипы. BV может быть диагностирована с помощью окрашивания по Граму и оценка Ньюджент может быть установлена для контроля за ошибочных выводов по результатам BV.
Сексуальная активность имеет огромное влияние на половых иммунологии, так как алло-ответы на спермы может вызвать быстрые и значительные изменения в челл фенотип и торговля. Действительно, Лажуа др.. описали различия в ЛПМ белкового состава между работниками секс-бизнеса и не-секс-работников, с изменениями, происходящими в течение первых нескольких лет после начала секс-бизнеса.
Наконец, культурные практики, такие как спринцевания представит еще один вариант в выборке слизистой оболочки. В зависимости от используемого реагента (отбеливатель, моющие средства, лимонный сок и т.д.), спринцевание может снизить частоту / фенотип клеточных популяций или изменять аутофлюоресценция по сравнению с другими образцами. В идеале, спринцевание до цитощеточка выборки следует поощрять доноров.
Будущие приложения: В дополнение к уступая важное понимание регуляции слизистых оболочек во время менструального / гормональный изменчивости, вирусный / бактериальной инфекции и до / после менопаузы, анализ проб слизистой имеет особое значение для исследований вакцин против ИППП / слизистых патогенов. В случае ВИЧ,где одной из основных целей исследований вакцин является, чтобы вызвать антитела слизистой или Т-клеточный ответ, развитие анализов CMC основе будет играть решающую роль в определении корреляты защиты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm cell strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5 ml tube Eppendorf | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
- Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract. Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).
- Douek, D. HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut. Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).
- Hofer, U., Speck, R. F. Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection. Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).
- Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment. American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).
- Hladik, F., Hope, T. J. HIV infection of the genital mucosa in women. Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).
- Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus. Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).
- St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis. Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).
- Liebenberg, L. J., et al. Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract. Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).
- Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa. PloS one. 6, (2011).
- Hasselrot, K., et al. Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya. PloS one. 7, (2012).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, (2014).
- Lajoie, J., et al. A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers. Mucosal immunology. 5, (2012).
- Burgener, A., et al. Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers. Journal of proteome research. 10, (2011).
- Burgener, A., et al. A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression. Journal of virology. 87, (2013).
- Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional. Immunology. 139, (2013).
- McKinnon, L. R., et al. Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility. Journal of immunology. , (2011).
- Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract. Immunology. 130, 23-33 (2010).
- Iqbal, S. M., et al. Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers. The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).
- Hirbod, T., et al. Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women. Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).
- Horton, R. E., et al. A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells. PloS one. 4, (2009).
- Begaud, E., et al. Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans. Retrovirology. 3, 35 (2006).
- McLaren, P. J., et al. HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors. The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).
- Card, C. M., et al. Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence. PloS one. 7, (2012).
- Prodger, J. L., et al. Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status. Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).
- Reusch, L. M., et al. Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure. Journal of biomedical optics. 18, (2013).
- Oertelt-Prigione, S.
- Rahman, S., et al. Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders. American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).
