Collectie, Isolatie, en Flowcytometrische analyse van de menselijke Endocervicale Monsters
Summary
The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.
Abstract
Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.
Introduction
De meerderheid van de nieuwe hiv-infecties wereldwijd ontstaan door heteroseksuele overdracht, met vrouwen die 47% van de nieuwe infecties in 2011 (UNAIDS 1). Inzicht in de vrouwelijke geslachtsorganen (FGT), een van de belangrijkste toegangspoort portals voor HIV en andere seksueel overdraagbare ziekteverwekkers, is van groot belang op de weg naar het vinden van efficiënte strategieën om infectie te voorkomen. Immuunreacties op de genitale slijmvliezen zijn duidelijk uniek en verschillen van die gemeten in het perifere bloed 2. Echter, de huidige kennis van het immuunsysteem dynamiek de FGT hoogstens beperkt. Tot op heden, hebben de studies van het mucosale immuunsysteem milieu grotendeels gericht op de darm-geassocieerd lymfeweefsel (GALT), waar het duidelijk is geworden dat de vroege gebeurtenissen in mucosale weefsels na infectie hebben een sterke invloed op latere progressie van de ziekte 3,4. Monsters van het genitale slijmvlies vormt een grote uitdaging en is ten minste gedeeltelijk verantwoordelijk voor de lack aan inzicht in de immunologie van de FGT. Oplossen van de puzzel van het immuunsysteem dynamiek tussen gastheer en pathogeen in het kader van de verschillende milieu dat de FGT vereist efficiënte methoden voor het verzamelen en analyseren van monsters van deze locatie.
De FGT is verdeeld in twee delen: het bovenste voortplantingsorganen dat de eileiders, endometrium en endocervix en de onderste luchtwegen die de ectocervix bevat en de vagina bevat (beoordeeld door Kaushic et al. 5). Het is nog onduidelijk wat de relatieve bijdrage van deze verschillende locaties is voor HIV-infectie, maar aangenomen wordt dat beide sites kunnen bijdragen aan HIV ingang 6. T-cellen vertegenwoordigen 40-50% van de leukocyten in de bovenste en onderste voortplantingsstelsel, terwijl macrofagen omvatten ongeveer 10% (beoordeeld in Rodriguez-Garcia et al. 2). T-cellen kunnen worden gedetecteerd in de vagina, cervix en endometrium. Macrofagen sterker localized in het endometrium en het myometrium bindweefsel dan de baarmoederhals, hoewel zij kunnen worden gedetecteerd in beide weefsels. Tenslotte kan plasmacytoïde dendritische cellen (pDCs) en Langerhans-cellen worden gedetecteerd in FGT weefsels. Het fenotype en verhoudingen van immune populaties en de gevoeligheid voor HIV-infectie belangrijk variëren hormonale cycli, het gebruik van hormonale anticonceptiemiddelen, bacteriële vaginose of seksuele activiteiten 5,7-9.
Diverse werkwijzen zijn ontwikkeld om het immuunsysteem bevolking en omgeving van de FGT bestuderen. Cervicale biopsie, cervicale cytobrushes en cervicovaginal lavages (CVL) 10-12 worden het meest gebruikt in de literatuur. CVL collectie PBS spoeling de eenvoudigste werkwijze en maakt de studie van immuun modulerende eiwitten maar resulteert in extreem lage celopbrengst, en is daarom niet geschikt voor het bestuderen van de immuuncel populaties van de FGT 13. CVL monsters, anderzijds, very nuttig voor de beoordeling immune omgeving van de FGT door het meten van de expressie van verschillende cytokinen, chemokinen of antimicrobiële factoren behulp van methoden zoals ELISA, cytokine bead matrix 14 of massaspectrometrie 15,16. Karakterisering van immuuncellen frequenties fenotypes en functies kunnen worden gerealiseerd door het verzamelen van cervicale cellen (CMC) door cervicale cytobrush of cervicale biopsie bemonstering.
Cervicale biopsie sampling is een invasieve methode die het ongemak en risico van bloeden verhoogt en duurt 2-11 dagen om te genezen na de procedure, afhankelijk van de immuunstatus van de vrouw 12. Anderzijds, cervicale cytobrushes, ondanks de lagere opbrengst aan cellen gewonnen, is een minder invasief en meer handige methode om immuuncellen te verzamelen van de FGT. Beide methoden kunnen dezelfde opbrengst van CD45 + leukocyten bereiken, maar twee opeenvolgende cervicale cytobrushes nodig zijn om dezelfde hoeveelheid cellen bevatte vinden in een biopsie 13. Toch cytobrush sampling geeft nog een aanvaardbaar aantal cellen (ongeveer 5.000 CD45 + cellen / cytobrush) voor verdere ex vivo fenotypering van flowcytometrie 14. Ook functionele karakterisering kan worden uitgevoerd op deze monsters uitgevoerd, zoals stimulatie en intracellulaire flowcytometrie of qPCR zijn uitgevoerd met behulp van cytobrush afgeleid CMC HIV-specifieke immuunrespons 17 of Th cel polarisatie 18 identificeren. Uitbreiding van de populatie T-cellen kunnen ook functionele studies met CMC 19 vergemakkelijken.
Het is belangrijk op te merken dat de biopsieën en cytobrushes proeven van verschillende gedeelten van de FGT. Biopsies afkomstig van de superieure deel van het epitheel en stroma van de ectocervix 12,13, terwijl cervicale cytobrushes proeven van de baarmoederhals, het verzamelen cellen afkomstig van het epitheel van endocervix en vermoedelijk de transformatie zone. Cytobrush monsters proeven dus een reGion samengesteld uit een enkele laag van cilinderepitheel, terwijl biopten, omvatten een gebied omzoomd door een geschubde gelaagd epitheel 5. Dientengevolge, de aard van de leukocyt populaties door cervicale biopsie en cytobrush verzameld verschilt. Biopten verzamelen van een groter deel van de CD3 + T-cellen, terwijl cytobrushes resulteren in collectie van een groter deel van CD14 + monocyten / macrofagen 13.
Het bestuderen van de immunologie van de FGT heeft een belang al vele jaren 20-22 en we hebben veel expertise met de studie van cytobrush afgeleide CMC geaccumuleerd. Onze studies richten zich vooral op de studie van HIV-geïnfecteerde, niet-geïnfecteerde en HIV-blootgestelde seronegatieve (HESN) vrouwelijke sekswerkers uit Nairobi, Kenia. HIV voorkeur repliceert in geactiveerde T-cellen 23 en lagere aantallen van geactiveerde cellen die kunnen worden gericht door HIV in de FGT zou kunnen bijdragen tot de bescherming tegen HIV overname. In lijn met deze hypothese, diverse studies hebben lagere immuunactivatie onder HESN sekswerkers die zeer blootgesteld aan HIV beschreven Nog blijven geïnfecteerde 24,25 en dit latente fenotype wordt ook waargenomen in de FGT 14. We beschrijven hier methodologie voor verwerking en evaluatie van T-cellen activatie CMC monsters verkregen uit cervicale cytobrushes door ex vivo flowcytometrie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gezien de grote hiaten in de kennis met betrekking tot de immuniteit bij de vrouwelijke geslachtsorganen (FGT), kan fenotypische analyse van CMC's een breed scala aan inzichten in meerdere lymfocytenpopulaties op de baarmoederhals. In combinatie met proteomics analyse en viral load metingen in cervicale lavage, kan immuniteit voor seksueel overdraagbare aandoeningen (soa) s en andere ziekteverwekkers worden ontleed in verschillende populaties.
Technische overwegingen – CMC:</stro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Joshua Kimani, clinical director of the research program at the University of Nairobi, for his assistance with mucosal immunology studies related to this protocol. The authors would like to acknowledge funding from CHVI grant MOP 86721.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal Bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5ml tube ependroff | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation Buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
- . UNAIDS. Global Report 2013. http://www.unaids.org/en/media/unaids/contentassets/documents/epidemiology/2013/gr2013/UNAIDS_Global_Report_2013_en.pdf. , (2013).
- Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract. Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).
- Douek, D. HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut. Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).
- Hofer, U., Speck, R. F. Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection. Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).
- Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment. American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).
- Hladik, F., Hope, T. J. HIV infection of the genital mucosa in women. Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).
- Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus. Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).
- St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis. Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).
- Liebenberg, L. J., et al. Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract. Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).
- Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa. PloS one. 6, (2011).
- Hasselrot, K., et al. Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya. PloS one. 7, (2012).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, (2014).
- Lajoie, J., et al. A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers. Mucosal immunology. 5, (2012).
- Burgener, A., et al. Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers. Journal of proteome research. 10, (2011).
- Burgener, A., et al. A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression. Journal of virology. 87, (2013).
- Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional. Immunology. 139, (2013).
- McKinnon, L. R., et al. Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility. Journal of immunology. , (2011).
- Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract. Immunology. 130, 23-33 (2010).
- Iqbal, S. M., et al. Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers. The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).
- Hirbod, T., et al. Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women. Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).
- Horton, R. E., et al. A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells. PloS one. 4, (2009).
- Begaud, E., et al. Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans. Retrovirology. 3, 35 (2006).
- McLaren, P. J., et al. HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors. The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).
- Card, C. M., et al. Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence. PloS one. 7, (2012).
- Prodger, J. L., et al. Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status. Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).
- Reusch, L. M., et al. Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure. Journal of biomedical optics. 18, (2013).
- Oertelt-Prigione, S. Immunology and the menstrual cycle. Autoimmunity reviews. 11, (2012).
- Rahman, S., et al. Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders. American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).
