Innsamling, Isolation, og flowcytometrisk analyse av menneskelige endocervikale prøver

Summary

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Abstract

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

Introduction

Flertallet av nye HIV-infeksjoner i verden oppstår gjennom heteroseksuell smitte, med kvinner som representerer 47% av nye infeksjoner i 2011 (UNAIDS ^1). Forstå det kvinnelige kjønnsorgan (FGT), en av de viktigste inngangsportaler for HIV og andre seksuelt overførbare patogener, er av stor betydning på veien til å finne effektive strategier for å hindre smitte. Immunresponser ved genital slimhinne er klart unikt og skiller seg fra de som er målt i perifert blod ^to. Imidlertid er dagens kunnskap om immun dynamikk på FGT begrenset i beste fall. Hittil har studier av slimhinnene immun miljøet i stor grad fokusert på gut-assosiert lymfoid vev (GALT), hvor det har blitt klart at de tidlige hendelser i slimhinnevevene følgende infeksjon har en sterk innvirkning på påfølgende sykdomsprogresjon ^3,4. Prøvetaking fra underlivet mucosa representerer en stor utfordring og er i det minste delvis ansvarlig for lack av forståelse for immunologi av FGT. Løse gåten om immun dynamikken mellom vert og patogen i sammenheng med den distinkte miljø som er FGT nødvendiggjør effektive metoder for innsamling og analyse av prøver fra denne locale.

Den FGT er delt inn i to deler: den øvre skjede som inkluderer egglederne, endometrium og livmorhalsen, og den nedre kanalen som inneholder ectocervix og skjeden (anmeldt av Kaushic et al ^5). Det er fortsatt uklart hva som er den relative bidraget av disse ulike nettstedene til HIV-infeksjon, men det antas at begge områder kunne bidra til HIV oppføring ^seks. T-celler utgjør 40-50% av leukocyttene i de øvre og nedre forplantningsveiene, mens makrofager utgjør ca 10% (vurdert i Rodriguez-Garcia et al ^2). T-celler kan påvises i vagina, cervix og endometrium. Makrofager er sterkere lokaliseringzed i endometriet og myometrial bindevev enn livmorhalsen, selv om de kan påvises i begge vevene. Endelig kan plasmacytoid dendrittiske celler (PDCs) og Langerhans-celler også påvises i FGT vev. Den fenotype og proporsjoner av immun populasjoner og deres mottakelighet for HIV-smitte kan variere viktigere ifølge hormonelle sykluser, bruk av hormonelle prevensjonsmidler, bakteriell vaginose eller seksuelle aktiviteter ^5,7-9.

Diverse metoder har blitt utviklet for å studere immun populasjoner og miljø i FGT. Livmorhals biopsi, cervical cytobrushes og cervicovaginal lavages (CVL) ^10-12 er den mest brukte over litteraturen. CVL samling av PBS kylling er den enkleste metoden og gjør studiet av immunmodulator proteiner, men resulterer i ekstremt lave celle yield, og er derfor ikke egnet for å studere immuncellepopulasjoner av FGT ^13. CVL prøver er, på den annen side, veri nyttig for evaluering av immun miljø av FGT ved å måle ekspresjonen av forskjellige cytokiner, kjemokiner eller antimikrobielle faktorer ved hjelp av metoder så som ELISA, cytokin bead matrise ¹⁴ eller massespektrometri ^15,16. Karakterisering av immuncellefrekvensene, fenotyper og funksjoner kan oppnås ved å samle cervikale mononukleære celler (CMC) ved cervikal cytobrush eller ved cervikal biopsiprøver.

Cervical biopsiprøver er en invasiv metode som øker ubehaget og risikoen for blødning og tar 2 til 11 dager for å helbrede ved å følge prosedyren avhengig immunstatus til kvinnen ^12.. På den annen side, cervikal cytobrushes, til tross for det lavere utbytte av celler samles, er en mindre invasiv og mer praktisk fremgangsmåte for å samle inn immunceller fra FGT. Begge fremgangsmåter kan nå det samme utbytte av CD45 +-leukocytter, men to sekvensielle cervikale cytobrushes er nødvendig for å oppnå den samme mengde av celler inneholdt in en biopsi ^13. Likevel gir cytobrush prøvetaking fortsatt et akseptabelt antall celler (ca 5000 CD45 + celler / cytobrush) for ytterligere ex vivo phenotyping av flowcytometri ^14. Dessuten kan funksjonelle karakterisering utføres på disse prøvene, som stimulering og intracellulær flowcytometri eller qPCR er blitt utført ved hjelp av cytobrush-avledet CMCs for å identifisere HIV-spesifikke immunresponser ¹⁷ eller Th cellepolarisering ^18.. Utvidelse av T-celler befolkning kan også legge til rette for funksjonelle studier med CMCs ^19.

Det er viktig å merke seg at biopsier og cytobrushes prøve forskjellige deler av FGT. Biopsier er utledet fra den overlegne del av epitel og stroma av ectocervix ^12,13, mens livmorhals cytobrushes smake livmorhalsåpningen, samle celler avledet fra epitel av livmorhalsen og antagelig transformasjon sone. Cytobrush prøver derfor prøve en region består av et enkelt lag av columnar epitel, mens biopsier, omfatter et område omgitt av en plateepitel stratifisert epitel ^fem. Som et resultat, skiller innholdet i leukocytter populasjoner innhentet av cervical biopsi og cytobrush. Biopsier samle en høyere andel av CD3 + T-celler, mens cytobrushes resultere i samlingen av en høyere andel av CD14 + monocytter / makrofager ^13.

Å studere immunologi av FGT har vært en interesse i mange år ^20-22, og vi har opparbeidet en stor kompetanse med studiet av cytobrush-avledet CMCs. Våre studier fokusere mest på studier av HIV-smittet, infisert og HIV-eksponerte seronegative (HESN) kvinnelige sexarbeidere fra Nairobi, Kenya. HIV fortrinnsvis replikerer i aktiverte T-celler ²³ og lavere antall aktiverte celler som kan bli målrettet av HIV i FGT kan bidra til beskyttelse mot HIV oppkjøpet. I tråd med denne hypotesen, flere studies har beskrevet lavere immunaktivering blant HESN sexarbeidere som er spesielt utsatt for hiv likevel forbli infisert ^24,25, og denne hvile fenotype er også observert i FGT ^14. Her beskriver vi metoden for behandling og vurdering av T-celler aktivering i CMC prøver fra livmorhalsen cytobrushes av ex vivo flowcytometri.

Protocol

Etikk uttalelse: De forskningsetiske styrene i både University of Manitoba og Kenyatta National Hospital / University of Nairobi godkjent denne studien og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltagerne. En. Utarbeidelse av Media og CMC Collection Tubes Forbered fosfatbufret saltvann (PBS) oppløsning (137,93 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na HPO 2 4, 1,47 mM KH 2 PO 4). Autoklav for sterilitet. Dette kan lagres ved 4 º C i flere må…

Representative Results

Multiparameter flowcytometri er et kraftig verktøy for å dissekere fenotyper og funksjoner av celle undergrupper i tidligere uncharacterized vev. Analyse av CMC prøver kan gi informasjon om både lymfocytter og monocytter populasjoner med passende gating strategier. En representativ CMC gating strategi, sammenliknet med en PBMC-profil, er vist i figur 2.. FSC-A versus FSC-H plott muliggjør utelukkelse av celle dubletter, som er svært utbredt i CMC prøvene sammenlignet …

Discussion

Gitt de store kunnskapshull med hensyn til immunitet på det kvinnelige kjønnsorgan (FGT), kan fenotypeanalyser av CMCs tilby et bredt spekter av innsikt i flere lymfocyttpopulasjoner på livmorhalsen. Sammen med proteomikk analyser og virusmengde målinger i cervical kylling, kan immunitet mot seksuelt overførbare infeksjoner (SOI) s og andre patogener bli dissekert i ulike populasjoner.

Tekniske hensyn – CMCs: Isolering og vellykket farging av CMC prøvene kan være utfo…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube	BD	352360	CMC processing
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	CMC processing
Fetal Bovine serum	Life technology	16000044	CMC processing
Fungizone	Life technology	15290-018	CMC processing
Penicillin/streptomycin	Sigma	P4333-20ml	CMC processing
50ml Falcon tube	Fisher	14-959-49A	CMC processing
Blood Bank disposable transfer pipette	Fisher	13-711-6M	CMC processing
Cytobrush plus	Cooper surgical	C0121	CMC sampling
Disposable cervical scraper	Quick medical	2183	CMC sampling
15 ml Falcon tube	Fisher	14-959-70c	CVL processsing
1.5ml tube ependroff	Fisher	05-402-18	CVL storage
LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit	Invitrogen	Various	Flow cytometry reagent
Fixation Buffer (4% PFA)	BD	554655	Flow cytometry regeant
IgG mouse	Sigma	I8765	Flow cytometry regeant