Coleção, isolamento e Citometria de Fluxo de Análise de Amostras endocervix Humano
Summary
The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.
Abstract
Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.
Introduction
A maioria das novas infecções pelo HIV em todo o mundo surgem através de transmissão heterossexual, com as mulheres representando 47% das novas infecções em 2011 (UNAIDS 1). Compreender o trato genital feminino (FGT), um dos principais portais de entrada para o HIV e outros patógenos sexualmente transmissíveis, é de grande importância no caminho para encontrar estratégias eficazes para prevenir a infecção. As respostas imunitárias a mucosa genital são claramente único e diferem dos que foram medidos no sangue periférico 2. No entanto, o conhecimento atual sobre a dinâmica do sistema imunológico no FGT é limitada na melhor das hipóteses. Até o momento, os estudos sobre o ambiente imune da mucosa em grande parte focada nos tecidos linfóides associados ao intestino (GALT), onde se tornou claro que os primeiros eventos em tecidos da mucosa após a infecção ter um forte impacto na posterior progressão da doença 3,4. A recolha de amostras a partir da mucosa genital representa um grande desafio e é pelo menos parcialmente responsável pela lack de compreensão da imunologia da FGT. Resolvendo o quebra-cabeça da dinâmica imunológico entre o hospedeiro eo agente patogénico no contexto do ambiente distinto que é o FGT necessita de métodos eficientes para a coleta e análise de amostras a partir desta localidade.
A FGT está dividido em duas partes: a parte superior do tracto reprodutivo, que inclui os tubos de Falópio, endométrio e endocervical, e do tracto inferior, o qual contém o ectocérvix e da vagina (revisto por Kaushic et al, 5). Não é ainda claro que a contribuição relativa de diferentes locais é a infecção pelo HIV, mas acredita-se que ambos os locais poderiam contribuir para a entrada do VIH 6. As células T representam 40-50% dos leucócitos do trato reprodutivo superiores e inferiores, enquanto que os macrófagos representam cerca de 10% (revisto em Rodriguez-Garcia et al 2). As células T podem ser detectadas na vagina, colo do útero, endométrio e. Os macrófagos são mais fortemente localized no endométrio e miométrio tecido conjuntivo do que o colo do útero, embora possam ser detectados em ambos os tecidos. Finalmente, as células dendríticas plasmacytoid (PDCs) e as células de Langerhans pode também ser detectada em tecidos FGT. O fenótipo e proporções de populações do sistema imunológico e a sua susceptibilidade à infecção por HIV pode variar de acordo com os ciclos importante hormonais, o uso de contraceptivos hormonais, a vaginose bacteriana ou actividades sexuais 5,7-9.
Diversos métodos foram desenvolvidos para estudar as populações imunes e Meio Ambiente da FGT. Biópsia do colo do útero, colo do útero e cytobrushes lavagens cérvico-vaginais (CVL) 10-12 são os mais comumente usados em literatura. Coleção CVL por PBS lavagem é o método mais simples e permite o estudo de proteínas moduladoras do sistema imunológico, mas os resultados no rendimento extremamente baixo da pilha, e não é, portanto, adequado para estudar as populações de células imunes do FGT 13. CVL amostras são, por outro lado, vEry útil para avaliar o ambiente imunológico do FGT medindo a expressão de diversas citocinas, quimiocinas e factores anti-microbianos, utilizando métodos tais como ELISA, citocina talão de matriz 14, ou espectrometria de massa de 15,16. Caracterização das frequências de células imunitárias, fenótipos e funções pode ser alcançado através da recolha de células mononucleares do colo do útero (CMC) por cytobrush cervical ou por amostragem de biopsia cervical.
Amostragem de biopsia cervical é um método invasivo, que aumenta o desconforto e risco de hemorragia e leva de 2 a 11 dias para curar seguindo o procedimento de acordo com o estado imunitário do mulher 12. Por outro lado, cytobrushes cervicais, apesar do rendimento mais baixo de células recolhidas, é um método menos invasivo e mais conveniente para recolher células do sistema imunológico do FGT. Ambos os métodos podem atingir o mesmo rendimento de leucócitos CD45 +, mas dois cytobrushes cervicais sequenciais são necessárias para se obter a mesma quantidade de células continha in uma biópsia 13. No entanto, a amostragem cytobrush ainda fornece um número aceitável de células (cerca de 5.000 células CD45 + / cytobrush) para posterior ex vivo fenotipagem por citometria de fluxo 14. Além disso, a caracterização funcional pode ser levada a cabo com as amostras, tal como a estimulação do fluxo intracelular e citometria de qPCR ou ter sido realizada utilizando derivados de CMC cytobrush para identificar as respostas imunitárias específicas para o HIV 17 ou polarização celular Th 18. Expansão da população de células T podem também facilitar estudos funcionais com CMC 19.
É importante notar que as biópsias e cytobrushes amostra porções distintas do FGT. As biópsias são derivados a partir da porção superior do epitélio e estroma da ectocérvix 12,13, enquanto cytobrushes cervicais amostra do orifício cervical, recolhendo as células derivadas do epitélio endocervical e presumivelmente da zona de transformação. Portanto amostras cytobrush provar uma região composto por uma única camada de epitélio, enquanto que as biópsias, incluem uma região revestida por um epitélio escamoso estratificado 5. Como resultado, a natureza das populações de leucócitos recolhidos por biopsia cervical e cytobrush difere. Biópsias recolher uma proporção mais elevada de células T CD3 +, ao passo que cytobrushes resultam na recolha de uma maior proporção de monócitos CD14 + / macrófagos 13.
O estudo da imunologia da FGT tem havido um interesse por muitos anos 20-22 e temos acumulado uma grande quantidade de conhecimentos com o estudo da CMC derivados de cytobrush. Nossos estudos se concentram principalmente no estudo do HIV-infectados, não infectados e expostas ao HIV soronegativos (HESN) profissionais do sexo de Nairobi, no Quênia. VIH replica preferencialmente em células T activadas 23 e inferior do número de células activadas que podem ser alvo de HIV no FGT poderiam contribuir para a protecção contra a infecção pelo VIH. Em linha com esta hipótese, vários studies descreveram ativação imune menor entre os trabalhadores do sexo HESN que estão altamente expostos ao HIV ainda permanecem não infectados 24,25, e este fenótipo quiescente também é observado no FGT 14. Aqui, descrevemos a metodologia para o processamento e avaliação de ativação de células T em amostras de CMC derivadas cytobrushes cervicais por ex vivo citometria de fluxo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dadas as grandes lacunas de conhecimento no que diz respeito à imunidade no trato genital feminino (FGT), análise fenotípica de CMC pode fornecer uma ampla gama de conhecimentos em várias populações linfocitárias no colo do útero. Juntamente com análise proteômica e medições da carga viral no lavado cervical, imunidade a infecções sexualmente transmissíveis (IST) s e outros patógenos pode ser dissecada em várias populações.
Considerações técnicas – CMC:…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Joshua Kimani, clinical director of the research program at the University of Nairobi, for his assistance with mucosal immunology studies related to this protocol. The authors would like to acknowledge funding from CHVI grant MOP 86721.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal Bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5ml tube ependroff | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation Buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
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