The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.
Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.
Majoriteten av nya hiv-infektioner i världen uppstår genom heterosexuell överföring, med kvinnor som representerar 47% av nya infektioner under 2011 (UNAIDS 1). Att förstå det kvinnliga könsorgan (FGT), en av de viktigaste ingångsportaler för hiv och andra sexuellt överförbara patogener, är av stor betydelse på vägen till att finna effektiva strategier för att förhindra infektion. Immunsvar på genitalslemhinnan är klart unik och skiljer sig från de som mäts i perifert blod 2. Dock är aktuell kunskap om immun dynamiken på FGT begränsad i bästa fall. Hittills har studier av slemhinnor immun miljön i hög grad fokuserat på tarmassocierad lymfvävnad (GALT), där det har blivit tydligt att de tidiga händelserna i slemhinnevävnader efter infektion har en stark inverkan på efterföljande sjukdomsutveckling 3,4. Samla prover från genitalslemhinnan är en stor utmaning och är åtminstone delvis ansvarig för lack förståelse för immunologi i FGT. Lösa pussel av immun dynamik mellan värd och patogen i samband med den distinkta miljö som är FGT kräver effektiva metoder för insamling och analys av prover från den här lokalen.
Den FGT är uppdelad i två delar: den övre reproduktiva tarmkanalen som inkluderar äggledarna, livmoderslemhinnan och endocervix samt nedre tarmkanalen som innehåller ectocervix och slidan (granskad av Kaushic m.fl. 5). Det är fortfarande oklart vad den relativa betydelsen av dessa olika platser är att HIV-infektion, men man tror att båda sidor skulle kunna bidra till HIV posten 6. T-celler som representerar 40-50% av leukocyterna i de övre och nedre fortplantningsvägarna, medan makrofager utgör cirka 10% (översikt i Rodriguez-Garcia et al, 2). T-celler kan detekteras i vagina, livmoderhalsen och livmoderslemhinnan. Makrofager är starkare localized i endometriet och myometrial bindväv än livmoderhalsen, även om de kan detekteras i båda vävnaderna. Slutligen kan plasmacytoid dendritiska celler (PDCs) och Langerhans celler också påvisas i FGT vävnader. Den fenotyp och proportioner av immuna populationer och deras mottaglighet för HIV-infektion kan variera allt beroende på hormonella cykler, användning av hormonella preventivmedel, bakteriell vaginos eller sexuella aktiviteter 5,7-9.
Olika metoder har utvecklats för att studera immun populationer och miljö i FGT. Cervikal biopsi, cervical cytobrushes och livmoderhals lavages (CVL) från 10 till 12 är det mest använda i hela litteraturen. CVL samling av PBS lavage är den enklaste metoden och tillåter studier av immunmodulerande proteiner, men resulterar i extremt låga cellutbyte, och är därför inte lämplig för att studera immuncellpopulationer i FGT 13. CVL prover är, å andra sidan, vEry användbara för att utvärdera immun miljön i FGT genom att mäta uttryck av olika cytokiner, kemokiner eller antimikrobiella faktorer med användning av metoder såsom ELISA, cytokin bead array 14 eller masspektrometri 15,16. Karaktärisering av immuncellfrekvenser, fenotyper och funktioner kan åstadkommas genom att samla in cervical mononukleära celler (CMC) genom cervikal cytobrush eller genom cervikal biopsi provtagning.
Cervikal biopsiprovtagning är en invasiv metod som ökar obehag och risk för blödning och tar 2 till 11 dagar att läka genom att följa förfarandet beroende på immunstatus hos kvinnan 12. Å andra sidan, cervical cytobrushes, trots den lägre utbyte av celler som samlats in, är en mindre invasiv och mera bekväm metod för att samla immunceller från FGT. Båda metoderna kan nå samma avkastning av CD45 + leukocyter, men två sekventiella livmoderhalscancer cytobrushes är nödvändigt för att få samma mängd celler innehöll in en biopsi 13. Icke desto mindre erbjuder cytobrush provtagning fortfarande ett acceptabelt antal celler (omkring 5000 CD45 + celler / cytobrush) för ytterligare ex vivo fenotypning med flödescytometri 14. Dessutom kan funktionell karakterisering utföras på dessa prover, såsom stimulering och intracellulär flödescytometri eller qPCR har utförts med användning av cytobrush härledda CMCs att identifiera HIV-specifika immunsvar 17 eller Th cell polarisering 18. Expansion av T-celler populationen kan också underlätta funktionella studier med CMC 19.
Det är viktigt att notera att biopsier och cytobrushes sampla distinkta partier av FGT. Biopsier är härledda från den överlägsna delen av epitel och stroma ectocervix 12,13, medan livmoder cytobrushes sampla livmodermunnen, samla celler härledda från epitel endocervix och förmodligen transformationszonen. Cytobrush prover sampla därför en region består av ett enda skikt av kolumnär epitel, medan biopsier, inkludera en region kantas av en skvamös stratifierat epitel 5. Som ett resultat skiljer sig den typ av leukocyt-populationer som samlats genom cervikal biopsi och cytobrush. Biopsier samla en större andel av CD3 + T-celler, medan cytobrushes resultera i uppsamling av en större andel av CD14 + monocyter / makrofager 13.
Att studera immunologi i FGT har varit ett intresse i många år 20-22 och vi har samlat ett stort kunnande med studiet av cytobrush-härledda CMC. Våra studier fokuserar främst på studier av HIV-smittade, oinfekterade och HIV-exponerade seronegativa (HESN) kvinnliga prostituerade från Nairobi, Kenya. HIV replikerar företrädesvis i aktiverade T-celler 23 och lägre antal aktiverade celler som kan riktas av HIV i FGT kan bidra till skydd mot HIV-förvärvet. I linje med denna hypotes, flera studies har beskrivits lägre immunaktivering bland HESN prostituerade som är mycket utsatta för HIV ändå förbli oinfekterade 24,25, och det vilande fenotyp är också observerats i FGT 14. Här beskriver vi metod för beredning och bedömning av T-celler aktiveras i CMC-prov härledda från cervikala cytobrushes genom ex vivo flödescytometri.
Med tanke på de stora kunskapsluckor när det gäller immunitet vid det kvinnliga könsorgan (FGT), kan fenotypisk analys av CMC maskiner ger ett brett spektrum av insikter i flera lymfocytpopulationer vid livmoderhalsen. Tillsammans med proteomik analyser och virusmängd mätningar i livmodersköljning, kan immunitet mot sexuellt överförbara infektioner (STI) s och andra patogener dissekeras i olika populationer.
Tekniska överväganden – CMC: Isolering och framgångsrik…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Joshua Kimani, clinical director of the research program at the University of Nairobi, for his assistance with mucosal immunology studies related to this protocol. The authors would like to acknowledge funding from CHVI grant MOP 86721.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
Fetal Bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
50ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
1.5ml tube ependroff | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
Fixation Buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |