التجديد الكلى في اسماك الزرد الكبار قبل جنتاميسين المستحثة الإصابات
Summary
Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.
Abstract
The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.
Introduction
الكلى أمر ضروري لتوازن السوائل، وتنظيم ضغط الدم وتنقية النفايات من الجسم. على الرغم من الثدييات قادرة على إصلاح النيفرون القائمة بعد الإصابة باستخدام الخلايا الظهارية متباينة 1-4، ويبدو أنها تفتقر إلى مجموعة من الخلايا الجذعية المحجوزة 5 وغير قادر على تشكيل النيفرون جديدة من جديد. وعلى النقيض من الثدييات والأسماك الكبار قادرون على تشكيل النيفرون جديدة في جميع أنحاء حياة الكبار لدعم نمو الأسماك وردا على إصابة 6،7. الزرد، دانيو rerio، هو كائن نموذجا لا تقدر بثمن لدراسة الجهاز تجديد 10/08 وديه القدرة على تقديم رؤى قوية في طلبات الحصول على هندسة إصلاح كلى الانسان. وقد تبين التحوير 11 لتسمية مجموعة من الخلايا كليون السلف في الكلى الزرد الكبار 12، ولكن آليات السيطرة على رد lhx1a + الخلايا لإصابة ص: تيراغرام (EGFP Lhx1a)emain غير واضح.
وجنتاميسين أمينوغليكوزيد هو مضاد حيوي يستخدم على نطاق واسع مع الآثار المعروفة كلى والسامة في البشر 13. حقن داخل الصفاق من الجنتاميسين هو طريقة المتبعة في إحداث إصابات الكلى الحادة في الأسماك 6. هذه الاصابة في يحاكي الأسماك فقدان خلايا الطلائية وتندب من الكبيبات التي تحدث في البشر بعد جنتاميسين جرعة زائدة من 14. حمل إصابة في الزرد عن طريق الحقن الجنتاميسين هو وسيلة مريحة للحمل لذلك، متزامن استجابة قوية تجديد، مع العديد من النيفرون الجديدة المنتجة والشروع في وقت واحد من خلال مراحل تشكيل وانتشار والتمايز.
هذا البروتوكول تفاصيل لدينا وسيلة لإصابة قوية وقابلة للتكرار في الزرد الكلى الكبار من خلال الاستفادة من عملية الفرز البصرية موسع للحد من القيم المتطرفة. علينا أن نستفيد من حقيقة أن إصابة مع الجنتاميسين يؤدي إلى موت الأنسجة الظهارية الكلى وشكلأيون من القوالب أنبوبي كلوي، والتي ثم تتراكم في الجماهير في القنوات الكلوة الجنينية الموسطة ومجرور. يتم تمرير هذه من الأسماك ويمكن ملاحظتها بالعين المجردة في الماء. وهذا يسمح لنا للكشف عن الأسماك مع إصابة غير قاتلة قوية، والتي يمكن بعد ذلك تجميعها لمزيد من التجارب. التقليل من أعداد الأسماك لم يصب أو الأسماك التي تموت قبل أن تصل إلى نقطة النهاية من التجربة يؤدي إلى أكثر اتساقا وكفاءة جمع البيانات وتحليلها. بالإضافة إلى ذلك، ليس هناك حاجة لأجهزة خاصة أو الكواشف، مما يجعل فعالية من حيث التكلفة هذه الطريقة ومناسبة للاستخدام في الأوساط الأكاديمية والتعليمية. باستخدام طريقة لدينا، ونحن هنا تظهر آثار زيادة جرعة جنتاميسين على تجديد الكلى، فضلا عن تأثير ارتفاع درجات الحرارة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الزرد مثالية لدراسة تجديد أجهزة الكبار بما في ذلك الكبار الكلى وولفي 6. وقد اتخذت الدراسات الحديثة الاستفادة من الواسمات الجزيئية وخطوط مراسل المعدلة وراثيا جديدة لتوصيف أفضل الخطوات التي تحدث أثناء كليون تجديد الخلايا وما قد تكون مسؤولة 7،12. وقد استخدم ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant F32DK091998 to CNK; NIH grant RO1DK041071 and Harvard Stem Cell Institute grant D001229 to IAD. The authors thank Neil Hukriede for the lhx1ain situ probe.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1xPBS for working solution |
References
- Humphreys, B. D., et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).
- Humphreys, B. D., et al. Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9226-9231 (2011).
- Guo, J. K., Cantley, L. G. Cellular maintenance and repair of the kidney. Annu Rev Physiol. 72, 357-376 (2010).
- Cirio, M. C., de Groh, E. D., de Caestecker, M. P., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. Kidney regeneration: common themes from the embryo to the adult. Pediatr Nephrol. , (2013).
- Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J Am Soc Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
- Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Dev Biol. 320, 161-174 (2008).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
- Swanhart, L. M., et al. Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish. Int J Dev Biol. 54, 731-736 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2011).
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288, F923-F929 (2005).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , (2011).
- Fogazzi, G. B., Cameron, J. S. Urinary microscopy from the seventeenth century to the present day. Kidney Int. 50, 1058-1068 (1996).
- Nachtrab, G., Czerwinski, M., Poss, K. D. Sexually dimorphic fin regeneration in zebrafish controlled by androgen/GSK3 signaling. Curr Biol. 21, 1912-1917 (2011).
- Zhou, W., Hildebrandt, F. Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish. J Am Soc Nephrol. 23, 1039-1047 (2012).
- Huang, J., et al. A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration. Kidney Int. 83, 1193-1200 (2013).
