ゲンタマイシン誘発性損傷によって大人ゼブラフィッシュにおける腎再生
Summary
Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.
Abstract
The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.
Introduction
腎臓は、身体からの体液の恒常性、血圧調節および廃棄物のろ過のために不可欠です。哺乳動物は怪我が分化した上皮細胞1-4を使用した後、既存のネフロンを修復することができますが、それらは予約済みの幹細胞5のプールを欠いているように見えるし、新しいネフロンデノボを形成することができません。哺乳類とは対照的に、成魚魚の成長および傷害6,7に応答をサポートするために、成人期を通じて新しいネフロンを形成することができます。ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュは 、臓器再生8-10の研究のための貴重なモデル生物であり、ヒトの腎臓の修復を操作するためのアプリケーションに強力な洞察を提供する可能性があります。 Tgは（Lhx1a：EGFP）導入遺伝子11は、しかし、機構が損傷rにlhx1a +細胞の応答を制御する、大人のゼブラフィッシュの腎臓12にネフロン前駆細胞のプールを標識することが示されています不明emain。
アミノグリコシドゲンタマイシンは、ヒト13における既知の腎毒性及び聴器毒性効果と広く使用されている抗生物質です。ゲンタマイシンの腹腔内注射は、魚6に急性腎損傷を誘導する確立された方法です。魚の模倣でこの傷害細管上皮や過剰摂取14ゲンタマイシンした後、ヒトに起こる糸球体の瘢痕化の損失。多くの新しいネフロンが生成され、同時に形成、増殖および分化の段階を経て進んでゲンタマイシン注射によってゼブラフィッシュにおける傷害を誘導することは、強力な、同期再生応答を誘導する便利な方法です。
このプロトコルは、外れ値を最小化するために非侵襲的な視覚的なスクリーニングプロセスを利用して大人のゼブラフィッシュの腎臓における堅牢性と再現性の損傷のための私達の方法を詳述します。私たちは、ゲンタマイシンとの損傷が、上皮腎臓組織と形式の死につながるという事実を利用しますその後、中腎管および排出腔に塊に蓄積し、尿細管円柱、のイオン。これらは、魚に渡され、水中で視覚的に観察することができます。これは、私たちはその後、さらなる実験のためにプールすることができる強力な非致死傷害、と魚をスクリーニングすることができます。これらは、実験のエンドポイントは、より均一で効率的なデータ収集と分析につながる達する前に死亡無傷魚または魚の数を最小限に抑えます。また、特別な装置や試薬は、この方法の費用対効果や学術や指導設定で使用するための適切なを作り、必要ありません。私たちの方法を使用して、ここでは、腎臓の再生にゲンタマイシン投与量の増大効果だけでなく、上昇した温度の影響を示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゼブラフィッシュは、大人の中腎腎臓6を含む成人の臓器の再生を研究するための理想的です。最近の研究では、より良いネフロンの再生中に発生するステップを特徴づけるために分子マーカーと新しいトランスジェニックレポーターラインを利用しているとどのような細胞が7,12責任を負うことがあります。尿円柱の観察は、ヒト16における腎疾患を診断するために一…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant F32DK091998 to CNK; NIH grant RO1DK041071 and Harvard Stem Cell Institute grant D001229 to IAD. The authors thank Neil Hukriede for the lhx1ain situ probe.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1xPBS for working solution |
References
- Humphreys, B. D., et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).
- Humphreys, B. D., et al. Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9226-9231 (2011).
- Guo, J. K., Cantley, L. G. Cellular maintenance and repair of the kidney. Annu Rev Physiol. 72, 357-376 (2010).
- Cirio, M. C., de Groh, E. D., de Caestecker, M. P., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. Kidney regeneration: common themes from the embryo to the adult. Pediatr Nephrol. , (2013).
- Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J Am Soc Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
- Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Dev Biol. 320, 161-174 (2008).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
- Swanhart, L. M., et al. Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish. Int J Dev Biol. 54, 731-736 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2011).
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288, F923-F929 (2005).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , (2011).
- Fogazzi, G. B., Cameron, J. S. Urinary microscopy from the seventeenth century to the present day. Kidney Int. 50, 1058-1068 (1996).
- Nachtrab, G., Czerwinski, M., Poss, K. D. Sexually dimorphic fin regeneration in zebrafish controlled by androgen/GSK3 signaling. Curr Biol. 21, 1912-1917 (2011).
- Zhou, W., Hildebrandt, F. Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish. J Am Soc Nephrol. 23, 1039-1047 (2012).
- Huang, J., et al. A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration. Kidney Int. 83, 1193-1200 (2013).
