Gentamicin प्रेरित चोट से वयस्क zebrafish में किडनी पुनर्जनन
Summary
Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.
Abstract
The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.
Introduction
गुर्दे शरीर से तरल पदार्थ समस्थिति, रक्तचाप विनियमन और कचरे के छानने का काम के लिए आवश्यक है। स्तनधारियों चोट विभेदित उपकला कोशिकाओं 1-4 उपयोग करने के बाद मौजूदा नेफ्रॉन मरम्मत करने में सक्षम हैं, वे सुरक्षित स्टेम कोशिकाओं 5 का एक पूल की कमी करने लगते हैं और नए नेफ्रॉन डी नोवो फार्म करने में असमर्थ रहे हैं। स्तनधारियों के विपरीत, वयस्क मछली चोट 6,7 करने के लिए मछली की वृद्धि और जवाब में समर्थन करने के लिए वयस्क जीवन भर नए नेफ्रॉन बनाने में सक्षम हैं। zebrafish, देनियो rerio, अंग उत्थान 8-10 के अध्ययन के लिए एक अमूल्य मॉडल जीव है और मानव गुर्दे की मरम्मत इंजीनियरिंग के लिए आवेदन पत्र में शक्तिशाली अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता है। टीजी (Lhx1a: EGFP) transgene 11 हालांकि, वयस्क zebrafish गुर्दे की 12 में चोट अनुसंधान करने के लिए + कोशिकाओं lhx1a की प्रतिक्रिया को नियंत्रित तंत्र नेफ्रॉन मूल कोशिकाओं का एक पूल लेबल करने के लिए दिखाया गया हैयह स्पष्ट नहीं emain।
aminoglycoside gentamicin मनुष्यों 13 में ज्ञात nephrotoxic और ototoxic प्रभाव के साथ एक व्यापक रूप से इस्तेमाल एंटीबायोटिक है। Gentamicin की intraperitoneal इंजेक्शन मछली 6 में तीव्र गुर्दे की चोट उत्प्रेरण की स्थापना की एक विधि है। मछली mimics में इस चोट ट्यूबलर उपकला और अधिक मात्रा 14 gentamicin के बाद मनुष्यों में पाया जाता है कि ग्लोमेरुली के scarring का नुकसान। Gentamicin इंजेक्शन द्वारा zebrafish में चोट उत्प्रेरण का उत्पादन कई नए नेफ्रॉन के साथ, एक मजबूत, तुल्यकालिक उत्थान प्रतिक्रिया उत्प्रेरण और एक साथ गठन, प्रसार और भेदभाव के चरणों के माध्यम से आगे बढ़ने का एक सुविधाजनक तरीका है।
इस प्रोटोकॉल outliers के लिए कम से कम करने के लिए एक noninvasive दृश्य जांच प्रक्रिया का उपयोग करके वयस्क zebrafish गुर्दे में मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट के लिए हमारे विधि का विवरण है। हम gentamicin साथ चोट उपकला गुर्दे ऊतक और प्रारूप की मौत हो जाती है कि इस तथ्य का लाभ उठाफिर मेसोनेफ्रिक नलिकाएं और क्लोअका में आम जनता में जमा है, जो गुर्दे ट्यूबलर डाले, के आयन। ये मछली द्वारा पारित कर रहे हैं और पानी में नेत्रहीन मनाया जा सकता है। यह हमें आगे तो प्रयोग के लिए जमा किया जा सकता है, जो मजबूत nonlethal चोट, साथ मछली के लिए स्क्रीन करने के लिए अनुमति देता है। वे प्रयोग के समापन बिंदु अधिक समान और कुशल डेटा संग्रह और विश्लेषण करने के लिए सुराग तक पहुंचने से पहले मर जाते हैं कि रिहाई मछली या मछली की संख्या कम से कम। इसके अलावा, कोई विशेष उपकरणों या अभिकर्मकों एक अकादमिक या शिक्षण की स्थापना में इस्तेमाल के लिए इस विधि लागत प्रभावी और उचित है, जिससे आवश्यक हैं। हमारे विधि का प्रयोग, यहाँ हम गुर्दे उत्थान पर gentamicin खुराक की बढ़ती प्रभाव के साथ ही तापमान में वृद्धि का असर दिखा।
Protocol
Representative Results
Discussion
zebrafish वयस्क मेसोनेफ्रिक गुर्दे 6 सहित वयस्क अंगों के उत्थान के अध्ययन के लिए आदर्श है। हाल के अध्ययनों से बेहतर नेफ्रॉन उत्थान के दौरान हो कि चरणों चिह्नित करने के लिए आणविक मार्कर और नए ट्रांसजेनिक…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant F32DK091998 to CNK; NIH grant RO1DK041071 and Harvard Stem Cell Institute grant D001229 to IAD. The authors thank Neil Hukriede for the lhx1ain situ probe.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1xPBS for working solution |
References
- Humphreys, B. D., et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).
- Humphreys, B. D., et al. Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9226-9231 (2011).
- Guo, J. K., Cantley, L. G. Cellular maintenance and repair of the kidney. Annu Rev Physiol. 72, 357-376 (2010).
- Cirio, M. C., de Groh, E. D., de Caestecker, M. P., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. Kidney regeneration: common themes from the embryo to the adult. Pediatr Nephrol. , (2013).
- Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J Am Soc Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
- Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Dev Biol. 320, 161-174 (2008).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
- Swanhart, L. M., et al. Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish. Int J Dev Biol. 54, 731-736 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2011).
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288, F923-F929 (2005).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , (2011).
- Fogazzi, G. B., Cameron, J. S. Urinary microscopy from the seventeenth century to the present day. Kidney Int. 50, 1058-1068 (1996).
- Nachtrab, G., Czerwinski, M., Poss, K. D. Sexually dimorphic fin regeneration in zebrafish controlled by androgen/GSK3 signaling. Curr Biol. 21, 1912-1917 (2011).
- Zhou, W., Hildebrandt, F. Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish. J Am Soc Nephrol. 23, 1039-1047 (2012).
- Huang, J., et al. A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration. Kidney Int. 83, 1193-1200 (2013).
