Real-time cytotoksisitetsanalyser i humant fullblod
Summary
Hele blod Cvtotoksisitetsmålinq (WCA) er en cytotoksisitet analyse utviklet ved å innlemme high-throughput celle posisjonering teknologi med fluorescens mikroskopi og automatisert bildebehandling. Her beskriver vi hvordan lymfomaceller behandlet med et anti-CD20-antistoff kan bli analysert i sanntid i humant fullblod for å tilveiebringe cellulær cytotoksisitet kvantitativ analyse.
Abstract
En levende cellebasert assay helblod cytotoksisitet (WCA) som gir tilgang til tidsmessige informasjon av den samlede celle cytotoksisitet er utviklet med high-throughput-celle posisjoneringsteknologi. De målrettede tumorcellepopulasjoner er først forhåndsprogrammert til immobilisering i en rekke format, og merket med grønne fluorescerende cytosoliske fargestoffer. Etter celle-matrise formasjonen, blir antistoff stoffer tilsettes i kombinasjon med humant helblod. Propidiumjodid (PI) blir deretter tilsatt for å vurdere celledød. Cellen matrise blir analysert med en automatisk avbildningssystem. Mens cytosolisk fargestoff etiketter målrettede tumorcellepopulasjoner, etiketter PI de døde tumorcellepopulasjoner. Således kan andelen av target cancer celledreping kvantifiseres ved beregning av antall overlevende målrettede celler til antallet døde målrettede celler. Med denne metoden forskerne er i stand til å få tilgang til tidsavhengig og doseavhengig celle cytotoksisitet informasjon. Bemerkelsesverdig, ingen farlig radiokjemikalier benyttes. Den WCA presenteres her har blitt testet med lymfom, leukemi, og solide tumorcellelinjer. Derfor lar WCA forskere for å vurdere medikament-effektivitet i en svært relevant ex vivo tilstanden.
Introduction
Nylige fremskritt innen den farmasøytiske industrien har ført til en økt interesse for å realisere de spesifikke identifikasjoner av tumorcelle antistoffer og personlige kreft behandlinger; imidlertid flere hindringer oppstått i prosessen. Kun 5% av agenter som har anticancer aktivitet i preklinisk utvikling er lisensiert etter å ha vist tilstrekkelig effekt i fase II-III testing 1,2. De prekliniske strategier (både in vitro og in vivo) som er suboptimal mange eksempler har vist at antitumorlegemidler oppfører seg forskjellig i mennesker og hos forsøksdyr hovedsakelig på grunn av deres forskjellige blodkomponenter 3-5.
For å møte behovet for en antitumormedikamentscreening plattformen og for å tilveiebringe en kontroll-punkt før kostbare dyreforsøk og kliniske forsøk, er en human fullblod analyse cytotoksisitet (WCA) foreslått for å evaluere antitumorlegemiddel effekt i en mer relevant biologisk miljø. Denhelblod cytotoksisitet Målingen kan brukes til å evaluere responsen av individuelle celler til antistoffer og andre legemiddelkandidater i humant helblod.
Den WCA er utviklet ved å innlemme high-throughput celle posisjonering teknologi med høy gjennomstrømming og høy-innhold bildebehandling 6. Ved å benytte et automatisert bildedanningssystem, kan antallet av både levende og døde celler bestemmes med en høy grad av presisjon. På grunn av det faktum at målcellene er immobilisert på den samme fokalplan, WCA er i stand til å gi kvantitative analyse cytotoksisitet i sanntid uten fjerning av røde blodceller. Videre gir den automatiske bildebehandlingssystemet flere fordeler som for eksempel at bare målceller som har nådd de angitte kriteriene (f.eks., Fluorescensmerkede celler og celle morfologi) er gated og bearbeides. Dessuten gjør det produksjonen av 144 plater per dag. Derfor tillater denne imaging evne og gjennomstrømning drift av high-content og high-throughput eksperimenter samtidig. Ved å kombinere WCA og automatisert bildesystem, kan høy gjennomstrømming kvantitativ celle cytotoksisitet analyser oppnås innenfor en mer biologisk relevant miljø.
Protocol
Representative Results
Discussion
WCA er en kritisk in vitro anti-kreft-screening verktøy med enkelt celle oppløsning 12-16, ideelt sett benyttes etter tradisjonelle mål screenings som CDC og ADCC analyser 9-11, og før prekliniske dyreforsøk. Foreløpig er primære målet utvelgelsesassays som CDC eller ADCC analyser alle utført i en forenklet media eller et buffersystem. Men legemiddelkandidater som viser effekt i disse forenklede buffersystem er ikke alltid effektive i mer komplekse fullblods system. Derfor kan WCA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker National Cancer Institute IMAT program fra NIH for finansiering dette arbeidet [R33 CA174616-01A1].
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Name/Discription |
| Cell attachment 96 well plate kits | Adheren | AP9601 | |
| Suspension Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0801 | |
| Adherent Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0802 | |
| Lymphoma cell line CD20+ | ATCC | CCL-86 | Raji cells |
| Lymphoma cell line CD20- | ATCC | CRL-8083 | MC/CAR |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Life Technologies | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Cytosolic dye | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilar) | Eureka Therapeutics | ||
| Human whole blood | Allcells | WB001 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | |
| Automatic imaging system | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
| Cell counting program | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
References
- Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates–where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
- Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
- Seok, J., et al. Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).
- Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).
- Eastwood, D., et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).
- Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution. PLoS One. 8, 10-1371 (2013).
- Wang, S. Y., Weiner, G. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin’s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).
- Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C. Monoclonal antibodies in clinical oncology. Anticancer Agents Med Chem. 8, 523-532 (2008).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (1983).
- Gerlier, D., Thomasset, N. J. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).
- Toriello, N. M., et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).
- Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array. Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).
- Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Current opinion in pharmacology. 9, 580 (2009).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. Automated image analysis for high-content screening and analysis. J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).
- Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Current Opinion in Biotechnology. 11, 47 (2000).
- Simmons, L. A. Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare. PERS MED. 9, 85 (2012).
