Echtzeit-Zytotoxizitätsassays in menschlichem Vollblut
Summary
Das Vollblut Zytotoxizitätsassay (WCA) ist ein Zytotoxizitätstest durch Einbau Hochdurchsatz-Zellpositionierungstechnologie mit Fluoreszenzmikroskopie und automatisierte Bildverarbeitung entwickelt. Hier beschreiben wir, wie Lymphom-Zellen mit einem anti-CD20-Antikörper behandelt werden können, in Echtzeit in menschlichem Vollblut zur quantitativen Analyse bereitzustellen zelluläre Zytotoxizität untersucht werden.
Abstract
Ein Live-zellbasierten Vollblut Zytotoxizitätstest (WCA), die Zugriff auf Zeitinformation des gesamten Zell-Cytotoxizität kann mit Hochdurchsatz-Zellpositionierungstechnologie entwickelt. Die gezielten Tumorzellpopulationen werden zuerst die Immobilisierung in ein Array-Format vorprogrammiert und mit grün fluoreszierenden cytosolischen Farbstoffen markiert. Im Anschluss an die Zellenanordnung Bildung werden Antikörper-Medikamenten in Kombination mit menschlichem Vollblut zugegeben. Propidiumiodid (PI) wird dann zugegeben, um den Zelltod zu bewerten. Die Zellenanordnung ist mit einem automatischen Abbildungssystem analysiert. Während cytosolischen Farbstoff beschriftet die gezielte Tumorzellpopulationen, Etiketten PI die toten Tumorzellpopulationen. Somit kann der Anteil der Ziel-Krebszelltötung durch die Berechnung der Anzahl der überlebenden Zellen gezielt auf die Anzahl der toten Zielzellen zu quantifizieren. Mit diesem Verfahren können die Forscher zeitabhängig und dosisabhängige Zell-Cytotoxizität Informationen zuzugreifen. Bemerkenswert ist, keine gefährliche RadioChemikalien verwendet werden. Die hier vorgestellte WCA hat mit Lymphom, Leukämie und soliden Tumorzelllinien getestet. Daher ermöglicht WCA Forscher Wirksamkeit von Medikamenten in einem hoch relevanten ex vivo Zustand zu beurteilen.
Introduction
Jüngste Fortschritte in der Pharmaindustrie haben zu einem erhöhten Interesse an der Verwirklichung der spezifischen Identifikationen von Tumorzell-Antikörper und personalisierte Krebstherapien führten; sind jedoch mehrere Hindernisse in dem Verfahren auftreten. Nur 5% der Mittel, die Antikrebsaktivität in der präklinischen Entwicklung haben werden, nachdem dafür ausreichende Wirksamkeit in Phase II-III Test 1,2 lizenziert. Die vorklinische Strategien (sowohl in vitro als auch in vivo) sind suboptimal, wie viele Beispiele wurden aufgrund ihrer unterschiedlichen Blutkomponenten 3-5 gezeigt, dass die Antitumor-Arzneimittel in der Human- und vor allem in Labortieren unterschiedlich verhalten.
Um die Notwendigkeit eines Antitumor Wirkstoff-Screening-Plattform zu wenden und eine Check-Punkt vor kostspielige Tierversuche und klinische Studien zu schaffen, ist eine menschliche Vollblut Zytotoxizitätsassay (WCA) zur Auswertung antitumorale Wirksamkeit von Medikamenten in einer relevanten biologischen Umgebung vorgeschlagen. DieVollblut-Zytotoxizitätstests können verwendet werden, um die Reaktion einzelner Zellen, Antikörper und andere Wirkstoffkandidaten in menschlichem Vollblut zu bewerten.
Der WCA wird durch den Einbau von Hochdurchsatz-Zellpositionierungstechnologie mit hohem Durchsatz und High-Content-Imaging-6 entwickelt. Durch Verwendung eines automatischen Abbildungssystem kann sowohl die Anzahl der lebenden und toten Zellen, die mit einem hohen Grad an Genauigkeit bestimmt werden. Aufgrund der Tatsache, dass die Zielzellen auf der gleichen Brennebene immobilisiert ist WCA Lage, quantitative Zytotoxizität Analyse in Echtzeit ohne die Entfernung der roten Blutzellen bereitzustellen. Darüber hinaus stellt die automatische Abbildungssystem mehrere Vorteile, wie dass nur Zielzellen, die die angegebenen Kriterien erreicht haben (z. B. fluoreszenzmarkierten Zellen und Zellmorphologie) sind geschlossene und verarbeitet. Auch ermöglicht es die Produktion von 144 Platten pro Tag. Folglich diese Abbildungsfähigkeit und Durchsatz ermöglicht Betrieb von High-cNHALT und Hochdurchsatz-Experimenten gleichzeitig. Durch die Kombination von WCA und der Automated Imaging System können hohe Durchsatz quantitative Zellcytotoxizität Analyse innerhalb einer biologisch relevanten Umwelt erreicht werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
WCA ist ein kritischer in vitro Anti-Krebs-Screening-Tool mit Einzelzellauflösung 12-16, idealerweise nach traditionellen Zielvorführungen wie CDC und ADCC-Assays 9-11, und vor präklinischen Tierversuchen verwendet. Derzeit sind primäre Ziel Screening-Assays wie CDC oder ADCC-Assays alle in einer vereinfachten Medien oder eines Puffersystems durchgeführt. , Wirkstoffkandidaten, die Wirksamkeit in diesen vereinfachten Puffersystem zeigen, sind jedoch nicht immer wirksam in der komplexe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken National Cancer Institute IMAT Programm von NIH für die Finanzierung dieser Arbeit [R33 CA174616-01A1].
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Name/Discription |
| Cell attachment 96 well plate kits | Adheren | AP9601 | |
| Suspension Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0801 | |
| Adherent Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0802 | |
| Lymphoma cell line CD20+ | ATCC | CCL-86 | Raji cells |
| Lymphoma cell line CD20- | ATCC | CRL-8083 | MC/CAR |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Life Technologies | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Cytosolic dye | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilar) | Eureka Therapeutics | ||
| Human whole blood | Allcells | WB001 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | |
| Automatic imaging system | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
| Cell counting program | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
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