ヒト全血でのリアルタイム細胞毒性アッセイ
Summary
全血細胞毒性アッセイ（WCA）は、蛍光顕微鏡および自動化された画像処理をハイスループット細胞測位技術を組み込むことによって開発された細胞毒性アッセイである。ここでは、抗CD20抗体で処置したリンパ腫細胞の定量的な細胞傷害性分析を提供するために、ヒト全血中でリアルタイムに分析することができる方法について説明します。
Abstract
全体的な細胞毒性の時間情報へのアクセスを可能にする生細胞ベースの全血の細胞毒性アッセイ（WCA）は、ハイスループット細胞測位技術で開発されている。標的腫瘍細胞集団は、最初の配列形式に固定化予めプログラム、および緑色蛍光の細胞質ゾル色素で標識されている。セルアレイを形成した後、抗体医薬品は、ヒト全血との組合せで添加される。ヨウ化プロピジウム（PI）は、細胞死を評価するために添加される。セル配列は、自動画像化システムを用いて分析される。細胞質ゾルの色素が標的腫瘍細胞集団にラベルを付けながら、PIは死んだ腫瘍細胞集団にラベルを付けます。従って、標的癌細胞の殺傷の割合は死んだ標的細胞の数の標的細胞の生存数を計算することによって定量することができる。この方法では、研究者は、時間依存性および用量依存性の細胞毒性の情報にアクセスすることができる。驚くべきことに、有害ラジオません化学物質が使用されている。 WCAは、ここで提示リンパ腫、白血病、および固形腫瘍細胞株を用いて試験された。したがって、WCAは研究者が、関連性の高いex vivoの状態で薬効を評価することができます。
Introduction
製薬業界における最近の進歩は、腫瘍細胞抗体パーソナライズ癌治療の特定の識別を実現する上で関心が高まってきた。しかし、いくつかの障害は、プロセスで遭遇している。前臨床開発中の抗がん活性を有する薬剤のわずか5％がフェーズII-III試験の1,2で十分な有効性を示した後にライセンスされています。多くの例では抗腫瘍薬3-5主としてそれらの異なる血液成分にヒトおよび実験動物では異なる挙動を示すことが示されているように（in vitroおよびin vivoの両方で ）前臨床戦略は最適以下である。
抗腫瘍薬物スクリーニングプラットフォームの必要性に対処するために費用のかかる動物実験および臨床試験前のチェックポイントを提供するために、ヒト全血の細胞毒性アッセイ（WCA）は、より関連性の生物学的環境において抗腫瘍薬の有効性を評価するために提案されている。ザ·全血の細胞毒性アッセイは、抗体およびヒト全血の他の薬物候補への個々の細胞の応答を評価するために用いることができる。
WCAは、ハイスループットおよびハイコンテントイメージング6でハイスループット細胞測位技術を組み込むことによって現像される。自動化されたイメージングシステムを利用することにより、生きている細胞および死細胞の両方の数を高精度に判定することができる。による標的細胞は、同一の焦点面上に固定されているという事実のため、WCAは、赤血球を除去することなく、リアルタイムでの定量的細胞毒性分析を提供することができる。また、自動イメージングシステムは、その指定した基準に達した場合にのみ、標的細胞（ 例えば 、蛍光標識された細胞、および細胞形態）などのいくつかの利点ゲートされ、処理さを提供する。また、一日あたり144のプレートを製造することができる。したがって、この撮像能力とスループットが高いcの実行を可能にするontentハイスループット実験を同時に。 WCAおよび自動画像化システムを組み合わせることにより、高スループット定量的細胞毒性分析は、複数の生物学的関連性環境内で達成することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
WCAは、理想的にはそのようなCDCおよびADCCアッセイ9-11、などと前臨床動物試験の前に、伝統的なターゲットの上映の後に利用され、単一細胞の解像度12-16、を用いたin vitro抗がんスクリーニングツールにおいて重要である。現在、CDCまたはADCCアッセイの一次標的スクリーニングアッセイは、すべての単純化されたメディアまたは緩衝液系中で実施される。?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、この作品[R33 CA174616-01A1]を資金調達NIHから国立癌研究所のIMATプログラムに感謝します。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Name/Discription |
| Cell attachment 96 well plate kits | Adheren | AP9601 | |
| Suspension Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0801 | |
| Adherent Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0802 | |
| Lymphoma cell line CD20+ | ATCC | CCL-86 | Raji cells |
| Lymphoma cell line CD20- | ATCC | CRL-8083 | MC/CAR |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Life Technologies | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Cytosolic dye | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilar) | Eureka Therapeutics | ||
| Human whole blood | Allcells | WB001 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | |
| Automatic imaging system | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
| Cell counting program | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
References
- Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates–where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
- Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
- Seok, J., et al. Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).
- Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).
- Eastwood, D., et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).
- Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution. PLoS One. 8, 10-1371 (2013).
- Wang, S. Y., Weiner, G. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin’s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).
- Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C. Monoclonal antibodies in clinical oncology. Anticancer Agents Med Chem. 8, 523-532 (2008).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (1983).
- Gerlier, D., Thomasset, N. J. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).
- Toriello, N. M., et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).
- Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array. Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).
- Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Current opinion in pharmacology. 9, 580 (2009).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. Automated image analysis for high-content screening and analysis. J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).
- Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Current Opinion in Biotechnology. 11, 47 (2000).
- Simmons, L. A. Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare. PERS MED. 9, 85 (2012).
