Realtids cytotoxicitetsanalyser i humant helblod
Summary
Hela blod cytotoxicitetsanalys (WCA) är en cytotoxicitetsanalys utvecklats genom att införliva hög genomströmning cell positionering teknik med fluorescensmikroskopi och automatiserad bildbehandling. Här beskriver vi hur lymfomceller behandlade med en anti-CD20-antikropp kan analyseras i realtid i humant helblod för att tillhandahålla kvantitativ cellulär cytotoxicitet analys.
Abstract
En live cellbaserade helblod cytotoxicitetsanalys (WCA) som ger tillgång till temporal uppgifter av den totala cellcytotoxicitet utvecklas med hög genomströmning cellpositioneringsteknik. De riktade tumörcellpopulationer först förprogrammerad att immobilisering i en array format och märkta med gröna fluorescerande cytosoliska färgämnen. Efter cellanordningen bildningen är antikroppsläkemedel läggs i kombination med humant helblod. Propidiumjodid (PI) tillsätts sedan för att bedöma celldöd. Cellanordningen analyseras med ett automatiskt bildsystem. Medan cytosoliskt färgämne etiketter riktade tumörcellpopulationer, PI märker de döda tumörcellpopulationer. Sålunda kan den procentuella andelen av mål-cancercelldödande kvantifieras genom beräkning av antalet överlevande målsökta cellerna till antalet döda målceller. Med denna metod, forskare kan få tillgång till tidsberoende och dosberoende cellcytotoxicitet information. Anmärkningsvärt, inget farligt radiokemikalier används. Den WCA presenteras här har testats med lymfom, leukemi och solida tumörcellinjer. Därför låter WCA forskare för att bedöma läkemedlets effektivitet i en mycket relevant ex vivo skick.
Introduction
De senaste framstegen inom läkemedelsindustrin har lett till ett ökat intresse för att uppnå de särskilda identifiering av tumörcellsantikroppar och anpassade cancerbehandlingar; dock flera hinder påträffas i processen. Endast 5% av medel som har anticanceraktivitet i preklinisk utveckling är licensierade efter att ha visat tillräcklig effekt i fas II-III-testning 1,2. De prekliniska strategier (både in vitro och in vivo) är suboptimala så många exempel har visat att antitumörläkemedel beter sig annorlunda i mänskligt och hos försöksdjur huvudsakligen på grund av deras olika blodkomponenter 3-5.
För att möta behovet av en antitumör drug screening plattform och för att ge en check-point innan kostsamma djurförsök och kliniska prövningar, är ett humant helblod cytotoxicitetsanalys (WCA) som föreslås för utvärdering antitumör läkemedlets effektivitet på ett mer relevant biologisk miljö. Denhelblod cytotoxicitetsanalys kan användas för att utvärdera svaret av individuella celler till antikroppar och andra läkemedelskandidater i humant helblod.
Den WCA utvecklas genom att införliva hög genomströmning cell positioneringsteknik med hög genomströmning och hög halt avbildning 6. Genom att använda ett automatiserat avbildningssystem kan antalet av både levande och döda celler bestämmas med en hög grad av precision. På grund av det faktum att målceller immobiliseras på samma fokalplan, är WCA kunna tillhandahålla kvantitativ cytotoxicitet analys i realtid utan att avlägsna röda blodkroppar. Dessutom ger det automatiska avbildningssystemet flera fördelar såsom att endast målceller som nått de angivna kriterier (t.ex.., Fluorescerande celler och cell morfologi) är gated och bearbetas. Dessutom möjliggör det framställning av 144 plattor per dag. Följaktligen här bildkapacitet och genomströmning möjliggör körning av high-cINNEHÅLL och hög kapacitet experiment samtidigt. Genom att kombinera WCA och automatiserade bildsystemet, kan hög genomströmning kvantitativ cellcytotoxicitet analys uppnås inom en mer biologiskt relevant miljö.
Protocol
Representative Results
Discussion
WCA är en kritisk in vitro anti-cancerscreeningmetod med en enda cell upplösning 12-16, helst utnyttjas efter traditionella målgrupp filmvisningar såsom CDC och ADCC-analyser 9-11, och före prekliniska djurförsök. För närvarande är primära målgruppscreeninganalyser såsom CDC eller ADCC analyser allt utfört i en förenklad media eller ett buffertsystem. Emellertid drogkandidater som visar effekten i dessa förenklade buffertsystem är inte alltid effektiva i den mer komplexa h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar National Cancer Institute IMAT programmet från NIH för finansieringen av denna verk [R33 CA174616-01A1].
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Name/Discription |
| Cell attachment 96 well plate kits | Adheren | AP9601 | |
| Suspension Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0801 | |
| Adherent Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0802 | |
| Lymphoma cell line CD20+ | ATCC | CCL-86 | Raji cells |
| Lymphoma cell line CD20- | ATCC | CRL-8083 | MC/CAR |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Life Technologies | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Cytosolic dye | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilar) | Eureka Therapeutics | ||
| Human whole blood | Allcells | WB001 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | |
| Automatic imaging system | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
| Cell counting program | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
References
- Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates–where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
- Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
- Seok, J., et al. Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).
- Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).
- Eastwood, D., et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).
- Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution. PLoS One. 8, 10-1371 (2013).
- Wang, S. Y., Weiner, G. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin’s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).
- Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C. Monoclonal antibodies in clinical oncology. Anticancer Agents Med Chem. 8, 523-532 (2008).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (1983).
- Gerlier, D., Thomasset, N. J. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).
- Toriello, N. M., et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).
- Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array. Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).
- Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Current opinion in pharmacology. 9, 580 (2009).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. Automated image analysis for high-content screening and analysis. J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).
- Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Current Opinion in Biotechnology. 11, 47 (2000).
- Simmons, L. A. Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare. PERS MED. 9, 85 (2012).
