Summary

Gepaarde Whole Cell Opnamen in Organotypische hippocampus Slices

Published: September 28, 2014
doi:

Summary

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Abstract

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Introduction

Glutamaat receptoren bemiddelen de meerderheid van prikkelende synaptische transmissie in het centrale zenuwstelsel synapsen. De twee belangrijkste subtypes van ionotrope glutamaatreceptoren gelokaliseerd aan het hoofd van de wervelkolom postsynaptische membraan N-methyl-D-aspartaat (NMDA) en α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazool-4-proprioniczuur (AMPA) receptoren. Bij rust membraanpotentialen, AMPA receptoren dragen meeste postsynaptische stroom tijdens synaptische transmissie. In de hippocampus, het NMDA receptor speelt een belangrijke rol bij het ​​ontstaan ​​van veranderingen in het aantal AMPA-receptoren in het postsynaptische membraan: door als "koincidentiedetektor" 1 tot veranderingen in synaptische sterkte 1 initiëren de NMDA receptor deelneemt aan de synaptische mechanismen die worden verondersteld om te leren en het geheugen ondersteunen op een subcellulaire niveau. In reactie op depolarisatie van het postsynaptische neuron parallel aan presynaptische afgifte van transmitter, calcium komt via de NMDAreceptor AMPA receptor inbrengen of verwijderen 2 initiëren. Deze receptor dynamiek ten grondslag liggen synaps plasticiteit: een toename van de synaptische kracht is op lange termijn potentiëring 2,3 (LTP), terwijl een afname in synaptische kracht is op lange termijn depressie 4 (LTD). Daarom AMPA receptor beweging wordt verantwoordelijk geacht voor synaptische plasticiteit expressie, terwijl NMDA-receptoren wordt gedacht dat de inductie controleren.

Het bepalen van de precieze mechanismen die ten grondslag liggen aan synaptische transmissie en plasticiteit vereist het bestuderen van kleine populaties van synapsen, idealiter enkele synapsen. Terwijl sommige synapsen zeer geschikt voor onderzoek op dit niveau, bijvoorbeeld de calyx van Held 5 voor de meeste synaptische populaties is uiterst moeilijk door de kleine en diffuse aard van de synaptische verbindingen. Twee belangrijke elektrofysiologie technieken ontwikkeld enkelvoudige synaptische verbindingen onderzocht: het eerste is minimaal stimulatie, where een presynaptische vezel wordt verondersteld gestimuleerd extracellulair. De tweede techniek is gekoppeld opnamen, waarbij twee simultane gehele cellen opnames van synaptisch verbonden neuronen wordt uitgevoerd. Een groot voordeel van minimale stimulatie is dat het snel en relatief eenvoudig uit te voeren, waarbij de plaatsing van een extracellulair stimulerende elektrode in de axonale kanaal tegelijkertijd opnemen van een postsynaptische neuron. De primaire zorg bij het gebruik van deze techniek is dat betrouwbare stimulatie van een enkele cel zelden worden gegarandeerd proef na proef.

In de afgelopen vijftien jaar hebben we routinematig gebruikt gepaarde whole-cell opnames van twee synaptically verbonden piramidale neuronen 6-17. Het grote voordeel van deze techniek is dat slechts een presynaptische neuron consistent en betrouwbaar wordt gestimuleerd. Ook kan niet alleen elektrofysiologische karakterisering maar ook farmacologische manipulatie van het presynaptische neuron 6,18 </ Sup>. De waarschijnlijkheid van synaptische verbindingen tussen neuronen is laag, waardoor verbonden paren moeilijk te verkrijgen 19. Het gebruik van organotypische brain slice cultures omzeilt het obstakel als synaptische connectiviteit kan herstellen in vitro en bovendien de aard van de resulterende verbinding is vergelijkbaar met die van natief hersenweefsel 20. Bovendien organotypische kweken drukken LTP, LTD 7-10,12-15,21 en andere vormen van kortdurende synaptische plasticiteit inbegrip gepaarde puls facilitatie (PPF) en depressie (PPD) 6,22,23, waardoor plasticiteit mechanismen bestudeerd in paren neuronen. Hier beschrijven we de gedetailleerde methodologie betrokken succes bereiken gekoppeld opnamen in dit in vitro systeem. Deze informatie kan gemakkelijk worden aangepast aan andere experimentele systemen, waaronder acute segmenten en andere hersengebieden.

Protocol

Animal Ethics Verklaring: De in dit manuscript beschreven protocollen volgen de verzorging van dieren richtlijnen opgesteld door de Universiteit van Auckland en Stanford University. P7 rat pups werden gedood door snelle onthoofding. Hippocampale dissectie wordt onmiddellijk uitgevoerd zoals hieronder beschreven. 1 Organotypische hippocampus Slice Cultuur Voorbereiding Bereid dissectie Medium (alleen gebruikt voor het ontleden van de hersenen)….

Representative Results

Synaptische connectiviteit is duidelijk door het stimuleren van de presynaptische neuron om een ​​actiepotentiaal te vuren door het passeren van een depolariserende stroomstoot (meestal 20-50 jaar voor 20 msec) via de registratie-elektrode. De postsynaptische stroom trace wordt dan voor de aanwezigheid van een monosynaptic EPSC onderzocht opgeroepen Snel (<5 msec) en consistent latencies na de piek van de presynaptische actiepotentiaal (Figuur 3A). In de meeste experimenten meerdere postsynaptisc…

Discussion

Hier hebben we beschreven de vereisten voor de oprichting van een succesvolle gepaarde whole cell opnames in organotypische hippocampus slice culturen. Gepaarde opnames kunnen ook worden uitgevoerd in verschillende bereidingen, waaronder acute plakjes en gedissocieerde kweeksystemen 26,27. Hoewel de focus hier is op de inductie van langere vormen van synaptische plasticiteit (namelijk LTP en LTD), is het belangrijk dat gepaarde whole cell recordings in organotypische, acute slice markeren en gedissocieerde ce…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.

Materials

Organotypic cultures Paired recordings
Minimum Essential Medium Stable motorized micromanipulators 
Penicillin-Streptomycin solution  Shallow tissue bath
HEPES buffer solution DIC camera
1M Tris stock solution  Amplifier
Hank’s Balanced Salt Solution Computer
Horse Serum  Vibration isolation table
plastic-coated miniature spatulas  Upright microscope
soft paintbrush  Data acquistion and analysis software
manual tissue chopper Electrode puller
#2 filter paper Faraday cage
#5  forceps
Membrane inserts
CO2 incubator 
Dissection hood
Class II hood

References

  1. Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
  2. Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation – A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
  3. Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).
  4. Dudek, S. M., Bear, M. F. Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).
  5. Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay. Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).
  6. Pavlidis, P., Madison, D. V. Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture. Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).
  7. Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).
  8. Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation. Neuron. 29, 691-701 (2001).
  9. Montgomery, J. M., Madison, D. V. State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs. Neuron. 33, 765-777 (2002).
  10. Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state. BMC Neuroscience. 6, 48 (2005).
  11. Waites, C. L., et al. Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate. Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).
  12. Emond, M., et al. AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity. Journal of Physiology. 588, 1929-1946 (2010).
  13. Li, D., et al. SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity. Journal of Physiology. 589, 4491-4510 (2011).
  14. Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity. European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).
  15. Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus. Brain Research. 1435, 8-14 (2012).
  16. Arons, M. H., et al. Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling. Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).
  17. Montgomery, J. M., Madison, D. V. Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity. Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).
  18. Miles, R., Poncer, J. C. Pair recordings from neurones. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).
  19. Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
  20. Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).
  21. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  22. Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release. Journal of Physiology. 491, 163-176 (1996).
  23. Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).
  24. Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).
  25. DeBello, W. M., et al. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release. Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).
  26. Bekkers, J. M., Stevens, C. F. Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).
  27. Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP. Science. 252, 722-724 (1991).
  28. Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).
  29. Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome. Brain Research. 1440, 1-8 (2012).
  30. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  31. Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down’s syndrome. Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).
check_url/51958?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Fourie, C., Kiraly, M., Madison, D. V., Montgomery, J. M. Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices. J. Vis. Exp. (91), e51958, doi:10.3791/51958 (2014).

View Video