Парные Целые Записи Сотовые в Органотипической срезов гиппокампа

Summary

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Abstract

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Introduction

Рецепторы глутамата посредником большинство возбуждающей синаптической передачи в центральных синапсах нервной системы. Две основные подтипы ионотропных глутаматных рецепторов, локализованных на позвоночнике головки постсинаптической мембраны являются N-метил-D-аспартата (NMDA) и α-амино-3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-пропионовой кислоты (АМРА) рецепторов. В отдыхает мембранных потенциалов, АМРА-рецепторы несут большую часть постсинаптической тока во время синаптической передачи. В гиппокампе, рецептор NMDA играет ключевую роль в запуске изменения в ряде АМРА-рецепторов в постсинаптической мембраны: выступая в качестве "детектора совпадений" ¹ инициировать изменения в синаптической силы ^1, рецептор NMDA участвует в синаптических механизмов что, как полагают, лежат в основе обучения и памяти на субклеточном уровне. В ответ на деполяризации постсинаптического нейрона параллельно с пресинаптической выпуска передатчика, кальций входит через NMDAрецепторов инициировать введение рецептора АМРА или удаление ^2. Такая динамика рецепторов лежат синапса пластичность: увеличение синаптической силы является долгосрочное потенцирование ^2,3 (LTP), в то время как снижение синаптической силы является долгосрочной депрессии ⁴ (ООО). Поэтому движение рецептора АМРА, как полагают, несет ответственность за синаптической пластичности выражения, в то время как рецепторы NMDA, как полагают, контролировать его индукции.

Определение точных механизмов, лежащих передачу синаптическую пластичность и требует изучения малых популяций синапсов, в идеале одиночные синапсы. В то время как некоторые синапсы хорошо подходит для изучения на этом уровне, например, чашечки, удерживаемых ^5, для наиболее синаптических населения это крайне сложно вследствие малого и диффузного характера синаптических связей. Две основные методы электрофизиологии были разработаны для изучения одиночных синаптических связей: Первый минимальна стимуляция, порогае один пресинаптический волокна Предполагается стимулировали внеклеточно. Второй метод работает в паре записи, где два одновременных целые клеточные записи с синаптически связанных нейронов выполняется. Основным преимуществом минимальной стимуляции является то, что быстрое и относительно прост в исполнении, с участием размещение внеклеточного стимулирующего электрода в аксонов-кишечного тракта, одновременно записи с постсинаптического нейрона. Главной задачей при использовании этого метода является то, что надежным стимуляция одной клетки редко может быть гарантирована суда после судебного разбирательства.

За последние пятнадцать лет мы регулярно использовали в паре цельноклеточная записи с двух синаптически связанных пирамидальных нейронов ^6-17. Основным преимуществом этого метода является то, что только один пресинаптический нейрон последовательно и надежно стимулировали. Она также позволяет не только электрофизиологические характеристики, но и фармакологической манипуляции пресинаптической нейрон ^{6,18 <}/ SUP>. Тем не менее, вероятность синаптической связи между нейронами низка, что делает подключенные пары трудно получить ^19. Использование органотипических культур мозга срезов обходит это препятствие, как синаптической связи может восстановить в пробирке и тому природа полученного соединения аналогична в основном мозговой ткани ^20. Кроме того, органотипической культуры выразить LTP, ООО ^{7-10,12-15,21} и дополнительные формы краткосрочного синаптической пластичности в том числе содействия в паре-импульса (PPF) и депрессии (PPD) ^6,22,23, позволяя механизмы пластичности в быть изучены в пар нейронов. Здесь мы опишем детальную методику, участвующих в успешно достижения парные записи в этой системе в пробирке. Эта информация может быть легко адаптированы к другим экспериментальных системах, в том числе острых срезов и других областях головного мозга.

Protocol

О себе животных Этика: Протоколы, описанные в этой рукописи следовать указаниям по уходу за животными, установленные Университета Окленда и Стэнфордский университет. P7 крысята были подвергнуты эвтаназии быстрым обезглавливание. Гиппокампа рассечение затем немедленно…

Representative Results

Синаптические связи очевидно, стимулируя пресинаптическое нейрон стрелять потенциал действия, передавая деполяризующего импульса тока (обычно 20-50 Па в течение 20 мс) с помощью регистрирующего электрода. Постсинаптической, ток затем исследовали на присутствие моносинаптического EPSC вы…

Discussion

Здесь мы описали требования по созданию успешных парные целые записи клеток в органотипических гиппокампа культур срез. Парные записи также может быть выполнена в нескольких препаратов, в том числе острых ломтиками и диссоциированных культур систем ^26,27. Хотя основное внимание з…

Materials

Organotypic cultures			Paired recordings
Minimum Essential Medium			Stable motorized micromanipulators
Penicillin-Streptomycin solution			Shallow tissue bath
HEPES buffer solution			DIC camera
1M Tris stock solution			Amplifier
Hank’s Balanced Salt Solution			Computer
Horse Serum			Vibration isolation table
plastic-coated miniature spatulas			Upright microscope
soft paintbrush			Data acquistion and analysis software
manual tissue chopper			Electrode puller
#2 filter paper			Faraday cage
#5  forceps
Membrane inserts
CO2 incubator
Dissection hood
Class II hood