Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

Summary

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Abstract

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Introduction

Recettori del glutammato mediano la maggior parte della trasmissione sinaptica eccitatoria a livello delle sinapsi del sistema nervoso centrale. I due principali sottotipi di recettori ionotropici del glutammato localizzate alla testa dorso della membrana postsinaptica sono N-metil-D-aspartato (NMDA) e α-ammino-3-idrossi-5-methylisoxazole-4-proprionic acido (AMPA) recettori. A riposo potenziali di membrana, i recettori AMPA portano la maggior parte della corrente post-sinaptica durante la trasmissione sinaptica. Nel ippocampo, il recettore NMDA svolge un ruolo chiave nello scatenare variazioni nel numero di recettori AMPA nella membrana postsinaptica: agendo come un "rivelatore coincidenza" ¹ per avviare cambiamenti nella forza sinaptica ^1, il recettore NMDA partecipa ai meccanismi sinaptici che si pensa di sostenere l'apprendimento e la memoria a livello subcellulare. In risposta alla depolarizzazione del neurone postsinaptico in parallelo con rilascio di neurotrasmettitore presinaptico, calcio entra attraverso l'NMDArecettore per avviare l'inserimento dei recettori AMPA o la rimozione ^2. Queste dinamiche recettori sono alla base della plasticità sinaptica: un aumento della forza sinaptica è a lungo termine ^2,3 potenziamento (LTP), mentre una diminuzione della forza sinaptica è la depressione a lungo termine ⁴ (LTD). Quindi il movimento del recettore AMPA è pensato per essere responsabile di espressione plasticità sinaptica, mentre i recettori NMDA sono pensati per controllare la sua induzione.

Determinare i precisi meccanismi alla base della trasmissione sinaptica e la plasticità è necessario studiare piccole popolazioni di sinapsi, idealmente singole sinapsi. Mentre alcune sinapsi sono molto adatti per lo studio a questo livello, ad esempio, il calice di Held ^5, per le popolazioni più sinaptici questo è estremamente difficile a causa della natura piccola e diffusa delle connessioni sinaptiche. Due principali tecniche di elettrofisiologia sono state sviluppate per esaminare le connessioni sinaptiche singoli: il primo è la stimolazione minima, DOVe una fibra presinaptica si presume stimolata extracellulare. La seconda tecnica è accoppiato registrazioni, in cui si svolge due registrazioni di cellule intere simultanee da neuroni sinapticamente collegati. Un vantaggio importante di stimolazione minima è che è rapido e relativamente semplice da eseguire, coinvolgendo il posizionamento di un elettrodo di stimolazione extracellulare nel tratto assonale e contemporaneamente registrare da un neurone postsinaptico. La preoccupazione principale quando si utilizza questa tecnica è che la stimolazione affidabile di una singola cellula può raramente essere garantita prova dopo prova.

Negli ultimi quindici anni abbiamo abitualmente utilizzati accoppiato registrazioni whole-cell da due neuroni piramidali sinapticamente collegati ^6-17. Il principale vantaggio di questa tecnica è che solo neurone presinaptico è coerente e affidabile stimolato. Inoltre permette non solo la caratterizzazione elettrofisiologica, ma anche la manipolazione farmacologica del neurone presinaptico ^{6,18 <}/ Sup>. Tuttavia, la probabilità di connettività sinaptica tra neuroni è basso, accoppiando collegati difficile ottenere ^19. L'utilizzo di culture fetta cerebrale organotipica aggira questo ostacolo come connettività sinaptica può ristabilire in vitro ed inoltre la natura della connettività risultante è simile a quello nel tessuto cerebrale nativo ^20. Inoltre, culture organotipiche esprimono LTP, LTD ^{7-10,12-15,21} e ulteriori forme di plasticità sinaptica a breve termine, tra cui la facilitazione paired-pulse (PPF) e depressione (PPD) ^6,22,23, consentendo meccanismi di plasticità a essere studiato in coppie di neuroni. Qui si descrive la metodologia dettagliata coinvolti nel raggiungimento di successo registrazioni appaiati in questo sistema in vitro. Questa informazione può essere facilmente adattato ad altri sistemi sperimentali, tra cui fettine acute e altre regioni del cervello.

Protocol

Etica Animale Dichiarazione: I protocolli descritti in questo manoscritto seguono le linee guida per la cura degli animali, istituito dall'Università di Auckland e la Stanford University. P7 ratti sono stati sacrificati da una rapida decapitazione. Dissezione ippocampale viene quindi eseguita immediatamente come descritto di seguito. 1 Organotipica ippocampale Fetta Cultura Preparazione Preparare dissezione Media (utilizzato solo per sezi…

Representative Results

Connettività Synaptic è evidente stimolando il neurone presinaptico a fuoco un potenziale d'azione passando un impulso di corrente depolarizzante (tipicamente 20-50 pA per 20 msec) tramite l'elettrodo di registrazione. La traccia corrente postsinaptica viene poi esaminato per la presenza di una EPSC monosinaptico evocata a breve (<5 msec) e latenze coerenti dopo il picco del potenziale d'azione presinaptico (Figura 3A). Nella maggior parte degli esperimenti più neuroni postsinaptici so…

Discussion

Qui abbiamo descritto i requisiti per la creazione di successo registrazioni di cellule intere associati nel organotipica culture fetta dell'ippocampo. Registrazioni accoppiati possono essere eseguite in diverse preparazioni, tra cui fettine acute e sistemi di colture dissociate ^26,27. Mentre il fuoco qui è stato sul induzione di forme di plasticità sinaptica (LTP e LTD cioè) più lunghi, è importante sottolineare che le coppie di registrazioni di cellule intere in organotipica, fetta acuta e dissocia…

Materials

Organotypic cultures			Paired recordings
Minimum Essential Medium			Stable motorized micromanipulators
Penicillin-Streptomycin solution			Shallow tissue bath
HEPES buffer solution			DIC camera
1M Tris stock solution			Amplifier
Hank’s Balanced Salt Solution			Computer
Horse Serum			Vibration isolation table
plastic-coated miniature spatulas			Upright microscope
soft paintbrush			Data acquistion and analysis software
manual tissue chopper			Electrode puller
#2 filter paper			Faraday cage
#5  forceps
Membrane inserts
CO2 incubator
Dissection hood
Class II hood