Herstellung von Ratten Serum Geeignet für Säugetier Whole Embryo Culture
Summary
Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.
Abstract
Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.
Introduction
Eine Vielzahl von Modelltiere sind in der Entwicklungsbiologie zur Entwicklungsmechanismen auf molekularer und zellulärer Ebene zu untersuchen. Zum Beispiel Amphibien-und Vogelspezies wurden weithin als klassische Modell Tiere, die für die direkte Behandlung der Embryonen sind, weil diese Embryonen entwickeln sich außerhalb der Mutter eingesetzt. Im Gegensatz zu diesen Tieren wachsen Säugetier-Embryonen in die Gebärmutter der Mutter, und das Wachstum in späteren Phasen hängt entscheidend von der Funktion der Gebärmutter. Daher ist es in der Regel schwierig, Säugetierembryos, wie sie aus der Maus und Ratte in einem frühen Stadium direkt zu manipulieren. In den 1960er Jahren wurde eine neue Denis ganze Säugetierembryokultur (WEC)-Technik mit WEC Geräte mit einer kontinuierlichen Sauerstoffzufuhr und Wärme ein. WEC können Maus-und Rattenembryos zu wachsen ex vivo (dh außerhalb des Uterus). Obwohl die WEC-Technik wurde oft in Teratologie durch Zugabe verschiedener chemic verwendetAl-Verbindungen in dem Kulturmedium wurde diese Technik auch in verschiedenen Entwicklungsbiologie Studien verwendet worden, um einzigartige Entwicklungsmechanismen in Säugetieren 2-4 zu prüfen. Zum Beispiel wird WEC mit anderen Techniken, wie z. B. Zellmarkierung, in Wildtyp-und Mutanten-Embryos unter Verwendung fluoreszierender Farbstoff 5, Zelltransplantation 6 und Gen-Einführung über 7 Lipofektion und Elektroporation 8-13 kombiniert.
Kürzlich wurde in utero Manipulation verwendet wurde, um Entwicklungsprozesse in Nagetierembryonen in späteren Stadien zu analysieren und mit Elektroporationsverfahren 14-16 zusammengefasst. Jedoch sind diese Techniken nicht für die Handhabung von Postimplantationsembryonen und midgestation aufgrund von Schwierigkeiten Erzielung einer genauen lokalen Injektion der DNA-Lösung in Embryonen im Frühstadium. Obwohl Ultraschall-geführte Zelltransplantation und Injektion von viralen Vektoren in frühen Embryonen (dh, E8.5-E-9.5 in der Maus) in utero wurde berichtet, zuvor 17,18, sind sehr gute Kenntnisse erforderlich, um diese Experimente mit einer hohen Erfolgsquote durchzuführen. Daher WEC mit hoher Zugänglichkeit ex vivo hat Vorteile in Bezug auf die Manipulation der Maus-und Rattenembryos.
Sofort zentrifugiert (IC) Rattenserum von männlichen Ratten vorbereitet wird oft für WEC Medium verwendet. Wenn Embryonen sind in der Postimplantationsstufe (dh früher als E8.0 im E10.0 Maus oder der Ratte) kultiviert wird eine Mischung aus synthetischen Mediums und IC Rattenserum häufig als Medium für WEC 19 verwendet. Doch die Kultur Embryonen in der Mitte der Schwangerschaft (dh., E8.0-12.5 in Maus-Embryonen oder E10.0-E14.5 in Rattenembryonen), 100% Serum sollte als Medium verwendet werden, da es derzeit keine alternative Medien ermöglicht Embryonen in vitro normalerweise länger als 2 Tage wachsen.
Die Herstellung von hochwertigen RattenserumEin entscheidender Schritt zur Erreichung Reproduzierbarkeit WEC Experimenten. Verglichen mit verzögerter Zentrifugation hat den IC Vorteil der Reduzierung der Hämolyse, wenn das Serum wird durch Zusammendrücken des Fibringerinnsels gesammelt, da die meisten der roten Blutzellen bereits aus der Fibrin-Gerinnsel getrennt. Als hämolytischer Rattenserum nicht auf das normale Wachstum der Ratten-und Maus-Embryonen zu unterstützen, ist die Herstellung von Serum mit sofortiger Zentrifugation bevorzugt Zubereitung mit verzögerter Zentrifugation. Unser Protokoll enthält zwei zusätzliche Schritte im Vergleich zu anderen Protokollen 18-20 (dh., Speichern des gesammelten Bluts auf Eis vor der ersten Zentrifugation und Halten der gesammelten Blutproben 2 h bei 4 º C nach der ersten Zentrifugation). Die ersteren Stufe die Bildung des Blutgerinnsels zu verzögern, und der letztere Schritt fördert die Verfestigung des Fibringerinnsels für einfache Quetschen. Daher kann unser Protokoll von Anfängern verwendet werden. Allerdings reproduzieren Blutentnahme und SerumExtraktion genau durch einfaches Protokoll Bücher bezieht, ist extrem schwierig, 19-21. In diesem Video-Beitrag zeigen wir, unsere Standard-Protokoll für die Herstellung der optimalen IC Rattenserum, die Blutentnahme aus der Bauchaorta von männlichen Ratten und Gewinnung von Serum durch Zentrifugation enthält.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reproduzierbare Ergebnisse in WEC Experimente sind abhängig von der Verwendung von hochwertigen IC Rattenserum und genaue Embryo Dissektionstechnik 3. Den Zeitraum des Fastens vor Blutentnahme nicht kürzen, weil das Fasten ist notwendig, um Glucose-Konzentrationen im Blut zu standardisieren. Weibliche Ratten, nicht zur Herstellung von Serum verwendet werden, da Hormonspiegel ändern bei weiblichen Tieren nach dem Östrus-Zyklus, und diese Änderungen in Hormone Östradiol für Embryokulturen geeignet sind. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Hajime Ichijo for video recording and helpful advice concerning editing the video. We also thank the Osumi lab members for animal care. This work is supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Area, Neural Diversity and Neocortical Organization, from MEXT of Japan (to N. O.). T. K. was supported by a Research Fellowship of JSPS for Young Scientists.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For anesthesia of rats. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
References
- New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. Introduction. Mammalian Postimplantation Embryos. A Practical Approach. , 1-14 (1990).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J Craniofac Genet Dev Biol. 5, 351-355 (1985).
- Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), e2170 (2010).
- New, D. A. Whole embryo culture, teratogenesis, and the estimation of teratologic risk. Teratology. 42, 635-642 (1990).
- Matsuo, T., et al. A mutation in the Pax-6 gene in rat small eye is associated with impaired migration of midbrain crest cells. Nat Genet. 3, 299-304 (1993).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Yamamoto, M., et al. Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo. Nature. 428, 387-392 (2004).
- Inoue, T., et al. Role of cadherins in maintaining the compartment boundary between the cortex and striatum during development. Development. 128, 561-569 (2001).
- Takahashi, M., Osumi, N. Pax6 regulates specification of ventral neurone subtypes in the hindbrain by establishing progenitor domains. Development. 129, 1327-1338 (2002).
- Calegari, F., Haubensak, W., Yang, D., Huttner, W. B., Buchholz, F. Tissue-specific RNA interference in postimplantation mouse embryos with endoribonuclease-prepared short interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14236-14240 (2002).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
- Pryor, S. E., Massa, V., Savery, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension analysis in mouse whole embryo culture. Methods Mol Biol. 839, 133-146 (2012).
- Kikkawa, T., et al. Dmrta1 regulates proneural gene expression downstream of Pax6 in the mammalian telencephalon. Genes Cells. 18, 636-649 (2013).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Turnbull, D. H. Ultrasound backscatter microscopy of mouse embryos. Methods Mol Biol. 135, 235-243 (2000).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J Vis Exp. (45), e2047 (2010).
- Quinlan, G. A., Khoo, P. L., Wong, N., Trainor, P. A., Tam, P. P. Cell grafting and labeling in postimplantation mouse embryos. Methods Mol Biol. 461, 47-70 (2008).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R., Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. Roller culture of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 237-241 (2003).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 391-393 (2011).
- Brown-Woodman, P. D., Ritchie, H. E., Korabelnikoff, A., Emmanuel, C. Replacement of ether with alternate volatile anesthetics for collection of rat serum used in embryo culture. Toxicol In Vitro. 18, 719-724 (2004).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J Vis Exp. (56), e3132 (2011).
- Machado, C. B., et al. Reconstruction of phrenic neuron identity in embryonic stem cell-derived motor neurons. Development. 141, 784-794 (2014).
- Glanville-Jones, H. C., Woo, N., Arkell, R. M. Successful whole embryo culture with commercially available reagents. Int J Dev Biol. 57, 61-67 (2013).
- Ornoy, A., Yacobi, S., Yaffee, P. A simple method of culture of 11.5-day-old rat embryos in DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum. J Anat. 203, 419-423 (2003).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System. J Vis Exp. (85), e50308 (2014).
