Preparación de suero de rata Adecuado para mamíferos Whole cultivo de embriones

Summary

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Abstract

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Introduction

Una variedad de modelos animales se utilizan en la biología del desarrollo para investigar los mecanismos de desarrollo a nivel molecular y celular. Por ejemplo, las especies de anfibios y aves han sido ampliamente utilizados como animales modelo clásico que son adecuados para la manipulación directa de embriones debido a que estos embriones se desarrollan fuera de la madre. En contraste con estos animales, los embriones de mamíferos crecen en el útero de la madre, y el crecimiento en etapas posteriores es crucialmente dependiente de la función del útero. Por lo tanto, normalmente es difícil de manipular directamente los embriones de mamíferos tales como los del ratón y la rata en las primeras etapas. En la década de 1960, Denis Nueva estableció un cultivo de embriones de mamíferos toda técnica (WEC), utilizando aparatos de WEC con un suministro de oxígeno continuo y control de calor ^1. En WEC, ratón y rata embriones pueden crecer ex vivo, (es decir, fuera del útero). Aunque la técnica de WEC fue utilizado a menudo en teratología, mediante la adición de varios chemicotros compuestos en el medio de cultivo, esta técnica también se ha utilizado en varios estudios de biología del desarrollo para examinar los mecanismos de desarrollo únicos en mamíferos ^2-4. Por ejemplo, el CME se combina con otras técnicas, como el etiquetado de las células, en los de tipo salvaje y mutante embriones mediante el uso de tinte fluorescente ^5, el trasplante de células ^6, y la introducción de genes a través de lipofección y electroporación ^{7 8-13.}

Recientemente, la manipulación en el útero se ha utilizado para analizar los procesos de desarrollo en embriones de roedores en etapas posteriores y se ha combinado con técnicas de electroporación ^14-16. Sin embargo, estas técnicas no son adecuadas para la manipulación de embriones postimplante y mitad de la gestación debido a dificultades para alcanzar la inyección local exacta de la solución de ADN en embriones en las primeras etapas. Aunque el trasplante de células guiada por ultrasonido y la inyección de vectores virales en embriones tempranos (es decir,, Se ha informado de E8.5-E-9.5 en el ratón) en el útero previamente ^17,18, se requieren excelentes habilidades para llevar a cabo estos experimentos con un alto índice de éxito. Por lo tanto, el CME con alta accesibilidad ex vivo tiene ventajas con respecto a la manipulación de embriones de ratón y rata.

Inmediatamente se centrifugó (IC) de suero de rata preparado a partir de ratas macho se utiliza a menudo para el medio WEC. Cuando los embriones se cultivan en la fase después de la implantación (es decir, antes de E8.0 en el ratón o E10.0 en la rata), una mezcla de medio sintético y suero de rata IC se utiliza a menudo como un medio para la WEC ^19. Sin embargo, a los embriones de cultivo a la mitad de la gestación (es decir., E8.0-12.5 en embriones de ratón E10.0-E14.5 o en embriones de rata), 100% de suero debe ser usado como un medio porque no hay medios de comunicación alternativa disponible actualmente permite embriones para crecer normalmente in vitro durante más de 2 días.

La preparación de suero de rata de alta calidad esun paso crítico para lograr la reproducibilidad en los experimentos de WEC. En comparación con retraso centrifugación, IC tiene el beneficio de reducir la hemólisis cuando el suero se recogió por apretar el coágulo de fibrina, porque la mayoría de las células rojas de la sangre ya se han separado del coágulo de fibrina. Como suero de rata hemolítica no apoya el crecimiento normal de los embriones de rata y ratón, la preparación de suero utilizando centrifugación inmediata es preferible a la preparación usando retraso centrifugación. Nuestro protocolo contiene dos pasos adicionales en comparación con otros protocolos ^18-20 (es decir., El almacenamiento de la sangre recogida en hielo antes de la primera centrifugación y el mantenimiento de las muestras de sangre recogidas durante 2 horas a 4 ° C después de la primera centrifugación). La etapa anterior puede retrasar la formación del coágulo de sangre, y el segundo paso promueve la solidificación del coágulo de fibrina para una fácil compresión. Por lo tanto, nuestro protocolo se puede utilizar por los principiantes. Sin embargo, la reproducción de la recogida de sangre y sueroextracción con precisión por una simple referencia a los libros de protocolo es extremadamente difícil ^19-21. En este artículo de vídeo, demostramos nuestro protocolo estándar para la preparación de suero de rata óptima IC, que incluye la recogida de sangre de la aorta abdominal de las ratas macho y la extracción del suero por centrifugación.

Protocol

NOTA: Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El Comité de Experimentación Animal de la Facultad de Medicina de la Universidad de Tohoku aprobó los procedimientos experimentales descritos en el presente documento. 1. Anestesia y laparotomía Para la recolección de la sangre, use ratas libres de patógenos específicos Sprague-Dawley…

Representative Results

La Figura 1 muestra los resultados representativos de los procedimientos descritos para la separación de células de la sangre y suero. Por lo general obtenemos 15 ml de sangre de una rata macho retirado (Figura 1A). Por centrifugación, la sangre recogida se puede separar en una capa superior que contiene el suero y el coágulo de fibrina, que se indica con una flecha, y una capa inferior que contiene las células de la sangre (Figura 1C). Es importante destacar que l…

Discussion

Resultados reproducibles en experimentos WEC dependen de la utilización de alta calidad IC suero de rata y técnica de disección precisa embrión ^3. No acortar el período de ayuno antes de la recogida de sangre, porque el ayuno es necesario normalizar las concentraciones de glucosa en la sangre. Las ratas hembras no deben ser utilizados para la preparación de suero debido a los niveles hormonales cambian en animales hembras de acuerdo con el ciclo estral, y tales cambios en las hormonas estradiol no son a…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Isoflurane	Abbott	B506	For anesthesia of rats.
Large scissors	Napox	B-7H	Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats.
Curved forceps	Napox	A-3-2	Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot.
Sprague-Dawley (SD) rat	Charles Rivers Laboratories		Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats.
Syringe (20 ml)	TERUMO	SS-29ESZ
Needle (21G x 5/8")	TERUMO	NN-2116R
Sterile test (spitz) tube (10 ml)	ASIAKIZAI	1101C000B-10	For collection of boold
Sterile disposable pipette	Eiken Chemical	CD2000 No.4
Sterilie disposable tube (15 ml)	Falcon	2196