Utarbeidelse av Rat Serum Egnet for Pattedyr Whole Embryo Kultur

Summary

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Abstract

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Introduction

En rekke modell dyr brukes i utviklingsbiologi å undersøke utviklingsmessige mekanismer ved de molekylære og cellulære nivåer. For eksempel har amfibier og fuglearter blitt mye brukt som klassiske modell dyr som er egnet for direkte manipulasjon av befruktede egg fordi disse embryoene utvikler utenfor moren. I motsetning til disse dyrene, pattedyrembryoer vokse i uterus hos moren, og vekst på senere stadier er i avgjørende grad avhengig av hvilken funksjon av livmoren. Derfor er det vanligvis vanskelig å manipulere direkte pattedyrembryoer slik som de fra mus og rotte ved tidlige stadier. I 1960, Denis Ny etablert et pattedyr hele embryo kultur (WEC) teknikken bruker WEC apparater med en kontinuerlig oksygentilførsel og varme kontroll ^en. I WEC, kan mus-og rotte-embryoer vokser ex vivo (det vil si utsiden av livmor). Selv om WEC teknikken ble ofte brukt i teratologistudie ved å legge ulike chemical forbindelser i kulturmediet, denne teknikken har også blitt brukt i forskjellige utviklingsbiologiske studier for å undersøke unike utviklingsmessige mekanismer i pattedyr ^2-4. For eksempel er WEC kombinert med andre teknikker, slik som cellemerking, i vill-type og mutante embryoer ved hjelp av fluorescerende fargestoff ^5, celletransplantasjon ^6, og genet innføring via lipofection ⁷ og elektroporering ^8-13.

Nylig, i utero manipulering har blitt brukt til å analysere utviklingsprosesser i gnager embryoer på senere stadier, og har vært kombinert med electroporation teknikker ^14-16. Imidlertid er disse teknikker er ikke egnet for manipulering av fostertap og midgestation embryoer på grunn av vanskeligheter med å oppnå nøyaktig lokal injeksjon av DNA-løsningen i embryoer i tidlig stadium. Selv om ultralydveiledet celletransplantasjon og injeksjon av virale vektorer i tidlige embryoer (dvs., E8.5-E-9.5 i mus) i utero har blitt rapportert tidligere ^17,18, blir gode ferdigheter som kreves for å utføre disse eksperimentene med en høy suksessrate. Derfor WEC med høy tilgjengelighet ex vivo har fordeler med hensyn til manipulering av muse-og rotte-embryoer.

Umiddelbart sentrifugert (IC) rotte serum forberedt fra hannrotter er ofte brukt for WEC medium. Når embryo dyrkes på fostertap scenen (dvs. tidligere enn E8.0 i musen eller E10.0 i rotte), er en blanding av syntetisk medium og IC rotte serum ofte brukt som et medium for WEC ^19. Men til kultur embryoer ved midten av svangerskapet (ie., E8.0-12.5 i muse embryoer eller E10.0-E14.5 i rotte embryoer), 100% serum bør brukes som et medium fordi ingen for tiden tilgjengelig alternativ media lar embryoer å vokse normalt in vitro for mer enn to dager.

Fremstilling av høykvalitets rotteserum eret avgjørende skritt for å oppnå reproduserbarhet i WEC eksperimenter. Sammenlignet med forsinket sentrifugering, har IC fordelen av å redusere hemolyse når serumet oppsamles ved å klemme på fibrinkoagel fordi de fleste av de røde blodlegemene allerede er skilt fra fibrinkoagel. Som hemolytisk rotteserum unnlater å støtte normal vekst av rotter og mus embryo, i fremstillingen av serum ved hjelp av umiddelbar sentrifuge å foretrekke fremfor fremstilling ved bruk av forsinket sentrifugering. Vår protokoll inneholder ytterligere to trinn i forhold til andre protokoller ^{18 til 20} (dvs.., Lagring av den oppsamlede blod på is før den første sentrifugering og vedlikehold av de innsamlede blodprøver i 2 timer ved 4 ° C etter den første sentrifugering). Den tidligere trinn kan forsinke dannelsen av blodpropp, og sistnevnte trinn fremmer størkning av fibrinkoagel for enkel klemme. Derfor kan vår protokoll brukes av nybegynnere. Men reprodusere blodprøvetaking og serumekstraksjon nøyaktig ved ganske enkelt å henvise til protokoll bøker er ekstremt vanskelig ^19-21. I denne video artikkelen, viser vi vår standard protokoll for fremstilling av optimal IC rat serum, som omfatter blodsamling fra abdominal-aorta hos hannrotter og utvinning av serumet ved sentrifugering.

Protocol

MERK: Dyreforsøk ble utført i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Komiteen for forsøk med dyr av Tohoku University School of Medicine godkjent forsøksprosedyrer som er beskrevet her. En. Anestesi og Laparotomi For blodprøvetaking, bruke spesifikke patogen-fri mannlige Sprague-Dawley rotter. Fast rottene i minst 18 timer samtidig som vann. Bruk pensjonerte mannlige oppdretter rotter ved 6-8 måned…

Representative Results

Fig. 1 viser representative resultater fra de beskrevne fremgangsmåter for separasjon av blodlegemer og serum. Vi vanligvis få 15 ml blod fra en pensjonert mannlig rotte (figur 1A). Ved sentrifugering, kan det oppsamlede blod separeres i et øvre sjikt inneholdende serum og fibrinkoagel, som er indikert med en pil, og et nedre lag som inneholder blodceller (figur 1C). Viktigere, kan hemolytiske blodprøver ikke deles inn i serum og blod lag (Figur 1b).</strong…

Discussion

Reproduserbare resultater i WEC eksperimenter er avhengig av bruken av høy kvalitet IC rotteserum og nøyaktig embryo disseksjon teknikk ^3.. Ikke forkorte perioden fastende før samling av blod, fordi faste er nødvendig for å standardisere glukosekonsentrasjonen i blodet. Hunnrotter bør ikke brukes for fremstilling av serum på grunn hormonnivået endres i hunndyr ifølge brunst, og slike endringer i østradiol hormoner er uegnet for embryokulturer. I tillegg bør svært fettstoffer hannrotter ikke benytt…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Isoflurane	Abbott	B506	For anesthesia of rats.
Large scissors	Napox	B-7H	Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats.
Curved forceps	Napox	A-3-2	Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot.
Sprague-Dawley (SD) rat	Charles Rivers Laboratories		Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats.
Syringe (20 ml)	TERUMO	SS-29ESZ
Needle (21G x 5/8")	TERUMO	NN-2116R
Sterile test (spitz) tube (10 ml)	ASIAKIZAI	1101C000B-10	For collection of boold
Sterile disposable pipette	Eiken Chemical	CD2000 No.4
Sterilie disposable tube (15 ml)	Falcon	2196