イメージング細胞内Ca<sup> 2+</sup遺伝的にエンコードされたカルシウム指標を用いて成体マウスからの線条体アストロサイト>シグナル
Summary
The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.
Abstract
Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.
Introduction
アストロサイトは、脳のユビキタスと豊富なグリア細胞である。これは、十分にアストロサイトが重要なサポートおよび細胞外空間におけるK +濃度のバッファリング、神経伝達物質の取り込みだけでなく、栄養素を提供することを含む恒常的な役割を果たしていることが確立されている。しかし、最近の研究では、それらはまた、自然に発生し、ニューロンの活動を1だけ増加された[Ca 2+] iの信号を表示することを示している。アストロサイトの存在は、の[Ca 2+] i のシグナリングはますますニューロンとのコミュニケーションを誘発すると考えられてきた、そのようなものとして、アストロサイト内の「Ca 2+の興奮性」の形式として解釈されてきた。最後の20年間の利用可能なデータは、アストロサイトとニューロンは、おそらく、双方向の方法で、通信することが可能な2つの設定が示唆された。まず、アストロサイトは、多くの場合は[Ca 2+] iは神経伝達物質によって活性化されたときの増加に対応し、ニューロン2から放出された神経修飾物質。第二に、アストロサイト内の[Ca 2+] i の増加は、順番に、ニューロンおよび血管に影響を与える可能性アストロサイトからのシグナル伝達分子の放出を引き起こす。証拠は、神経膠星状細胞から放出された分子は、アストロサイトへの神経シグナリングを介してシナプス回路、最終的に行動3-5の機能に変化をもたらすことを示唆している。しかし、これは急速に発展して研究領域のままであり、それがより良いとアストロサイトの詳細な理解がの[Ca 2+] iは 、現在の不確定要素6のいくつかを解決するために必要であると主張されています。
過去の研究では、アストロサイトへの有機物のCa 2+指示色素のバルク·ロードを確実に、培養中および in situ 7-10 全体の星状細胞内の[Ca 2+] i の信号の検出に失敗したことが示された。これらの知見は、米国および他の6,11,12によって議論されてきた。 emergingの画像は、ニューロンおよび血管との相互作用のための主要な部位であるアストロサイトのプロセス内の[Ca 2+] iの信号（ 例えば、枝や小枝）、ということで、めったに詳細に検討されていない。近年、細胞質ゾルGCaMP3などの遺伝的にコードされたカルシウム指示薬（GECIs）の使用は、GCaMP5GとGCaMP6とプラズマ膜テザーのバージョン（ 例えば 、Lckは-GCaMP3）は、そのようなアストロサイトの小区画内の[Ca 2+] iの信号の研究が可能になった薄いプロセスなどの、原形質膜に近いと7,8全体の領土内である。しかし、GECIs有機のCa 2+指示色素上の1つの欠点があり、GECIsが適切であることに発現する遺伝的方法は、数週間の期間にわたって、インビボでの星状細胞に選択的にコード化遺伝子を送達することが要件である。 in vivoでの発現は、典型的にノックインマウスまたはウイルスベースの送達アプリで、トランスジェニックマウスを使用して達成されるゴキブリ。現在のJoveの記事では、アデノ随伴ウイルスを使用して、線条体アストロサイトにGECIsを配信するために用いられる方法と手順を報告します。ここでは、例として、CYTO-GCaMP3に焦点を当てるが、同じ基本的な手順は、他のGECIまたは蛍光タンパク質ベースのレポーターのために働く。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書に記載の方法は、私たちは、その場で 、後続の[Ca 2+] iのイメージングのためのin vivoでの線条体アストロサイトにおけるCYTO-GCaMP3を表現することができました。この方法は、遺伝子組換えを使用して、またはノックイン実験的な実装および解剖学的特異性の標的タンパク質、迅速性と柔軟性の強固な発現を含むマウスに比べて利点を有する。 AAV2 / 5を使?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
仕事の大半は、関係職員は、NIH助成金NS060677によって、一部はNIHがMH099559と（BSKへ）MH104069の補助金によってサポートされていました。作品の一部は、CHDI財団によってサポートされていました。
Materials
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Micropipette grinder | Narishige | EG-40 | |
| pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 | Addgene | 44331 | a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging |
| I mL syringe | BD | 309628 | |
| syringe needle | BD | 305109 | |
| AAV2/5 virus | UPenn vector core | NA | |
| Sudan red IV | Sigma-Aldrich | 67386 | |
| Mineral oil | CVS Pharmacy | 152355 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900LS | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | FOREDOM | K.1070 | |
| Paraformaldehyde | Santa cruz biotechnology | sc-281692 | |
| Super Glue | Krazy®Glue | KG925 | |
| Microslicer | Ted Pella | DTK-Zero 1 | |
| Confocal microscopes | Olympus | FV300 and FV1000 | |
| Normal goat serum | Vector | S-1000 | |
| chicken anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
| mouse anti-s100β | Sigma-Aldrich | S2532 | |
| mouse anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| mouse anti-glutamine synthetase | Millipore | MAB302 | |
| goat anti-mouse-Alexa546 | Invitrogen | A11003 | |
| goat anti-chicken-Alexa488 | Invitrogen | A11039 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5J | |
| Mounting Medium | Vector | H-1000 |
References
- Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Khakh, B. S., North, R. A. Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS. Neuron. 76, 51-69 (2012).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
- Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice. J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).
- Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O’Dell, T. J., Khakh, B. S. TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release. J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).
- Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains. Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).
- Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).
- Shigetomi, E., Khakh, B. S. Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes. J Vis Exp. 26, (2009).
- Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).
- Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).
- Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo. Front Cell Neurosci. 7, 272 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2012).
- Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo. Nat Commun. 5, 3262 (2014).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).
- Eid, T., et al. Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy. Lancet. 363, 28-37 (2004).
- Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. Glutamate and astrocytes–key players in human mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).
- Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington’s disease model mice. Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).
- Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).
- Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
- Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat. Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).
