Imaging intracelular de Ca^{2 +} Las señales en estriatal astrocitos de ratones adultos a través de indicadores de calcio codificados genéticamente-

Summary

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca²⁺ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca²⁺ signals within striatal astrocytes in situ.

Abstract

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca²⁺ concentration fluctuations ([Ca²⁺]_i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca²⁺]_i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca²⁺]_i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca²⁺]_i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca²⁺]_i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca²⁺]_i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca²⁺]_i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca²⁺]_i signals in the striatal microcircuitry.

Introduction

Los astrocitos son células gliales ubicuas y abundantes del cerebro. Está bien establecido que los astrocitos sirven de soporte vital y las funciones homeostáticas que incluyen el almacenamiento en búfer de concentración de K ⁺ en el espacio extracelular, la captación de neurotransmisores, así como proporcionar nutrientes. Sin embargo, estudios recientes muestran que también muestran [Ca ^{2 +]} _i señales, que se producen de forma espontánea y se incrementan por la actividad neuronal ^1. La existencia de los astrocitos [Ca ^{2 +]} _i de señalización se ha pensado cada vez más para activar su comunicación con las neuronas, y como tal se ha interpretado como una forma de "Ca ²⁺ excitabilidad" dentro de los astrocitos. Los datos disponibles en las últimas dos décadas sugieren dos escenarios en los que los astrocitos y las neuronas pueden comunicarse, tal vez de una manera bidireccional. En primer lugar, los astrocitos a menudo responden con un aumento de la [Ca ^{2 +]} _i cuando se activa mediante neurotransmisores yneuromoduladores liberados por las neuronas ^2. En segundo lugar, la [Ca ^{2 +]} _i se incrementa dentro de los astrocitos provoca la liberación de moléculas de señalización de los astrocitos que a su vez puede afectar a las neuronas y los vasos sanguíneos. La evidencia sugiere que las moléculas liberadas a partir de astrocitos conducen a cambios en las funciones de las sinapsis, circuitos y en última instancia el comportamiento de ^3-5 a través de la señalización de astrocitos a neurona. Sin embargo, esto sigue siendo un área de investigación en rápido desarrollo, y se ha argumentado que una comprensión mejor y más detallada de los astrocitos [Ca ^{2 +]} _i es necesaria para resolver algunas de las incertidumbres actuales ^6.

En trabajos anteriores, se demostró que la carga a granel de orgánicos de Ca ²⁺ colorantes indicadores en los astrocitos no puede detectar con fiabilidad [Ca ^{2 +]} _i señales dentro de los astrocitos en la totalidad de la cultura e in situ ^7-10. Estos resultados han sido discutidos por nosotros y otros ^6,11,12. El Emerging imagen es que el [Ca ^{2 +]} _i señales dentro de los procesos de astrocitos (por ejemplo, ramas y ramillas), que son los sitios principales para la interacción con las neuronas y los vasos sanguíneos, rara vez han sido exploradas en detalle. Recientemente, el uso de indicadores de calcio codificados genéticamente (Gecis) tales como GCaMP3 citosólica, GCaMP5G y GCaMP6 y membrana plasmática versiones atados (por ejemplo, Lck-GCaMP3) ha permitido el estudio de la [Ca2 ^+] _i en las señales de pequeños compartimentos de astrocitos tales procesos como delgadas, cerca de la membrana plasmática y dentro de territorios enteros ^7,8. Sin embargo, tienen una desventaja Gecis sobre orgánicos Ca ²⁺ colorantes indicadores y que es el requisito de métodos genéticos para entregar los genes que codifican selectivamente a los astrocitos in vivo durante períodos de semanas para el Gecis sea apropiadamente expresado. Expresión in vivo se logra típicamente usando ratones transgénicos, knock-en ratones o con la entrega de aplicaciones a base de viruscucarachas. En el presente artículo JoVE informamos métodos y procedimientos empleados para entregar Gecis a los astrocitos del cuerpo estriado utilizando virus adeno-asociado. Nos centramos en cito-GCaMP3 como un ejemplo, pero el mismo procedimiento básico funciona para cualquier otra GECI o fluorescente reportero base de proteínas.

Protocol

Todos los animales protocolos fueron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la UCLA. 1.1) Preparar Micropipeta y AAV2 / 5 Virus Cargando Utilice micropipetas de vidrio de borosilicato finas para la inyección del virus. Tire de la micropipeta utilizando un programa tirando de dos pasos con un extractor vertical. Bevel la pipeta en un ?…

Representative Results

Para la expresión específica de astrocitos de cito-GCaMP3 en el cuerpo estriado, se utilizó virus adeno-asociado (AAV) del serotipo 5, y el promotor de GFAP GfaABC 1 D (Figura 1A), que se ha demostrado previamente para conducir GCaMP3 robusto y gen reportero expresión en astrocitos del hipocampo y corticales 8,14. Dos semanas después de la microinyección virus en el cuerpo estriado de ratón, el ratón (~ 10 semanas de edad) y se perfundió IHC se realizó en secciones de cer…

Discussion

Los métodos descritos en el presente documento nos han permitido expresar cito-GCaMP3 en astrocitos del cuerpo estriado en vivo para su posterior [Ca ^{2 +]} _i de imágenes in situ. Este método tiene ventajas sobre el uso transgénica o ratones knock-in, incluyendo la expresión robusta de la proteína objetivo, rapidez y flexibilidad de aplicación experimental y especificidad anatómica. La expresión de GCaMP3 usando AAV2 / 5 se encontró que era específica y robusta. La combin…

Materials

Syringe Pump	Harvard Apparatus	704506
Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Narishige	PC-10
Micropipette grinder	Narishige	EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3	Addgene	44331	a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
I mL syringe	BD	309628
syringe needle	BD	305109
AAV2/5 virus	UPenn vector core	NA
Sudan red IV	Sigma-Aldrich	67386
Mineral oil	CVS Pharmacy	152355
Cryostat	Leica	CM3050 S
Stereotaxic instrument	David Kopf Instruments	900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit	FOREDOM	K.1070
Paraformaldehyde	Santa cruz biotechnology	sc-281692
Super Glue	Krazy®Glue	KG925
Microslicer	Ted Pella	DTK-Zero 1
Confocal microscopes	Olympus	FV300 and FV1000
Normal goat serum	Vector	S-1000
chicken anti-GFP	Abcam	ab13970
mouse anti-s100β	Sigma-Aldrich	S2532
mouse anti-NeuN	Millipore	MAB377
mouse anti-glutamine synthetase	Millipore	MAB302
goat anti-mouse-Alexa546	Invitrogen	A11003
goat anti-chicken-Alexa488	Invitrogen	A11039
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-5J
Mounting Medium	Vector	H-1000