Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.
Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.
الزوج هناك وتجديد tissuesis واحد من الأهداف themain العلوم الطبية لأن الآفة في ororgan الأنسجة يمكن أن يكون تعجيزية، وفي بعض الحالات، قاتلة. في السياق، والعاملين الصحيين والباحثين يبحثون باستمرار التقنيات والأساليب والأدوات اللازمة لتوفير alternativesto علاجية جديدة تعزز هناك عملية زوج-تجديد الأنسجة التالفة. لذلك، ركزت العلوم الطبية الحيوية على دراسة الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة)، وخاصة الخلايا الجذعية البالغة، لأن هذا النسب خلية يمثل نموذجا مثاليا لدراسة عملية تجديد الأنسجة، وذلك بسبب قدرته على التفريق إلى الأدمة، أرومية متوسطة، والأديم الباطن الأنساب الخلية الا لجعل العلاج مع اللجان الدائمة واقعا، يجب أن يصاحب توصيف إمكانات thetherapeutic من اللجان الدائمة من تنفيذ تقنيات زراعة الخلايا الجديدة باستخدام المواد الحيوية والسقالات الخلوية التي تضمن السلوك المطلوب من اللجان الدائمة في النسيج المضيف.
<pالطبقة = "jove_content"> ويتمثل التحدي الرئيسي في التغلب عليها في تنفيذ ثقافة مع اللجان الدائمة في تجديد العظام هو لتأمين التصاق الخلايا على مادة بيولوجية محددة، الذي يعرض عموما بنية مسامية مع adistribution المسام تتراوح بين ميكرومتر إلى ملليمترات وقد استخدمت ولكن في كثير من الأحيان تتطلب الكواشف المتطورة والمعدات والإجراءات التي تغير سلوك الخلايا. هذه الإجراءات هي مناسبة لتقدير في المختبر، ولكن ليس لاستقراء وتنفيذها في النظم المفتوحة المعقدة، مثل الإنسان أو في المقايسات الجسم الحي. التقنيات التي تركز على ضمان التصاق الخلية إلى تصاميم عشوائية، مثل مواد مسامية العظام، وقد تم دراسة من قبل التصاق المواد إلى قاع الآبار الثقافة والكولاجين والبوليمرات الاغاروز المستخدمة. لهذه الأساليب، تم الإبقاء على الخلايا التي تم المصنفة على السطح في المسام وعلى السطح العلوي. ومع ذلك، لا يمكن ضمان هذا الجانب في في الجسم الحيالنظام، الذي سوائل الجسم المحيطة مادة بيولوجية يمكن سحب الخلايا من موقع المطلوب على السقالات المسامية هو استخدام التحفيز بالموجات فوق الصوتية، الأمر الذي يتطلب معدات متطورة ولكن يشجع على التعبير عن علامات بانيات العظم في فحوصات في المختبر 5. استخدام الثقافات مستمرة تتطلب المفاعلات الحيوية، والتي تضمن توزيع متجانس من المواد الغذائية في مستنبت. ومع ذلك، يتم فقدان نسبة كبيرة من الخلايا المستزرعة عند استبدال مستنبت نظرا لمعدل التدفق التي تستخدم في هذه التقنية والتمسك المتوسط على الجدران للمعدات. هذه القضايا تزيد من الكتلة الخلوية ما هو ضروري لهذا النوع من الثقافة والوقت للحصول على عدد كاف من خلايا 7. وهكذا، فإن المنهجية المقدمة في هذا العمل تمثل تقنية التي ينبغي استقراء لفي الجسم الحي النظم لأن المصنف الخلايا في كتلة متناهية الصغر على المواد السطحية العليا، وبعد appropriأكل مرات الحضانة، والتزمت 60٪ من كتلة الخلوية الأولية. وعلاوة على ذلك، لا يتطلب هذا الأسلوب إضافة المحاثات بانيات العظم (على سبيل المثال، ديكساميثازون، وحمض الأسكوربيك، أو بيتا سكرولي) أو المحفزات بالموجات فوق الصوتية للحث على تمايز بانيات العظم وصيانة النمط الظاهري العظمية بسبب NKB هو عظمي والسقالات osteoinductive 8، طريقة للثقافة اللجان الدائمة من الغشاء الذي يحيط بالجنين البشري (AM-hMSCs) على مادة بيولوجية العظام macroporous الواردة في هذا representsapossibility العمل على إدراج الخلايا في أنسجة العظام التالفة ولحث على تمايز لنسب بانية للعظم.وأظهرت الخلايا الجذعية التي تم الحصول عليها من الغشاء الذي يحيط بالجنين البشري (الشكل 1) مورفولوجيا تشبه الخلايا الليفية، على غرار خلايا اللحمة المتوسطة (الشكل 2)، وكانت أساسا اللجان الدائمة. وبالإضافة إلى ذلك، كشف التدفق الخلوي المقايسات أن هذه الخلايا كانت إيجابية للعلامات خلية الوسيطة (CD73، CD90، وCD105) والسلبية للعلامات النسب المكونة للدم (CD34، CD45) (الشكل 3). أيضا، وAM-hMSCs معزولة في هذا العمل الحالي القدرة على تشكيل CFUs (الشكل 6). وبالمثل، فإن الخلايا الجذعية الوسيطة معزولة في هذا النموذج احتفظت القدرة على نعلق على osteoinductor مادة بيولوجية (الشكل 4)، وتتكاثر على منصة الاعدام (الشكل 5).
لهذه الأسباب، فإن الطريقة ثقافة AM-hMSCs على macroporous مادة بيولوجية العظام التي تم استخدامها في هذا العمل يمثل فرصة لإدراج الخلايا داخل الأنسجة والعظام المصابين وحمل اح لهاntiation إلى النسب بانية للعظم. لا يتطلب هذا النظام الثقافة إضافة المحاثات عظمية للحفاظ على عملية التمايز النمط الظاهري بناء العظم وبانيات العظم بسبب NKB هو مادة عظمي andosteoinductive 8. استخدام الأنسجة النفايات، مثل المشيمة البشرية، يمثل بديلا بسيطا والأخلاقي للوصول إلى السكان من الخلايا الجذعية مع القدرة على التمايز إلى اللجان الدائمة، بالمقارنة مع المصادر الأخرى التي تنطوي على كثير من الأحيان أساليب الغازية أو العائد خلية منخفضة.
طريقة الثقافة المقترح يمكن استقراء لفي الجسم الحي النظم لأن المصنف الخلايا في كتلة متناهية الصغر على المواد السطحية العليا، والخلايا استعمار والتمسك سطح مادة بيولوجية كامل بعد العصر الحضانة المناسبة. وعلاوة على ذلك، ليس مطلوبا من الكواشف المتطورة والمعدات والإجراءات، على عكس الطرق القائمة عند تنفيذ هذه التقنية هي cultureas-الشامل الصغرى كذلكترسب بطيء وثابت من قسامة الخلوية على المواد للتأكد من أن الخلايا تتفاعل بشكل تفضيلي مع بيولوجية، وليس مع الجزء السفلي من لوحة. نقطة حرجة أخرى هي استخدام المواد المبللة مسبقا قبل زراعة الخلايا، وهذا يضمن أن الخلايا سيكون لها العناصر الغذائية الضرورية من مستنبت عندما يتم دمجها في المواد بغض النظر إذا كانوا على السطح أو داخل المسام. وأخيرا، فإن استخدام وسيلة بيولوجية osteoinductive أمر بالغ الأهمية لهذه العملية لأنه يتجنب بالإضافة للعوامل الخارجية للحث والحفاظ على بانيات العظم التمايز. الحد من هذه التقنية هو أنه يقوم على إمكانات osteoinductive من المصفوفة الأبقار. ومع ذلك، فإن نظام الثقافة المقترحة يمكن استقراء إلى أي مادة مسامية مع توزيع المسام بين 20 إلى 200 ميكرومتر. ولذلك، فإن الإجراء المعروضة في هذا العمل هو طريقة بديلة لزراعة الخلايا الجذعية الوسيطة في مختلف المواد رويعمل قبعة للهندسة الأنسجة، وخاصة بالنسبة للتجديد العظام.
The authors have nothing to disclose.
ونحن نعترف المنح الدراسية والدعم المالي المقدم من المجلس الوطني لCiencia بحوث والتكنولوجيا (CONACYT No.49887)، كلية الحقوق دي لطب-UNAM DGAPA IN201510 وDGAPA IN216213. سلفادور كوريا من المعهد الوطني للPerinatología للمساعدة مع المواد البيولوجية؛ وBiocriss، SA دي C. V للتبرع Nukbone. نشكر أيضا إلى ING. هيكتور مارتينيز من IIM، UNAM وM EN C فابيولا جونزاليس من CINVESTAV للحصول على المساعدة الفنية.
sterile phosphate buffered saline | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10010023 | cell culture |
penicillin-streptomycin | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10378016 | cell culture |
FBS | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 26140111 | cell culture |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 11965118 | cell culture |
collagenase type II | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 17101015 | cell culture |
3mM calcium chloride | SIGMA_ALDRICH | C5670 | cell culture |
trypsin/0.5mM EDTA solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | R001100 | cell culture |
Trypan Blue solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
FITC- CD90, | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
PE-CD34 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
FITC-CD45 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
PE-CD105 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Pharmigen | BD FACSCalibur | cytomery |
alamarBlue (AB) | LIFE TECHNOLOGIES | DAL1025 | proliferation cell assay |
SUNRISE-reader | TECAN, Germany | Sunrise | proliferation cell assay |