Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.
Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.
有配对并tissuesis 1的医学科学,因为在一个组织ororgan的病变可以是失能,并且在一些情况下,致命的themain目标的再生。在上下文中,卫生工作者和研究人员一直在寻找技术,方法和工具,提供了新的治疗同类软件推广有一双再生受损组织的过程。因此,生物医学科学的重点是间充质干细胞(MSC),尤其是成体干细胞的研究,因为这种细胞谱系表示研究该组织再生的过程中,一个理想的模型,由于其潜在的分化为外胚层,中胚层,内胚层和细胞谱系不过,为了使治疗用的MSC现实,MSC的thetherapeutic潜在的表征必须伴随着使用的生物材料和细胞支架是保证在宿主组织的MSCs的期望的行为的新的细胞培养技术的实施。
<p类=“jove_content”>的主要挑战,在与骨再生的MSC培养的执行,以克服是确保细胞粘附在选定的生物材料,其通常呈现具有孔,从微米到毫米的adistribution多孔结构已采用但经常需要复杂的试剂,设备和程序,改变细胞的行为。这些程序都适合在体外的估计,但不能用于外推和执行复杂的开放系统,如人或体内试验。技术,重点放在确保细胞粘附到随机地形,例如多孔骨材料,已经研究了由材料到培养孔的底部的密合性和所用的胶原蛋白和琼脂糖聚合物。对于这些方法,接种在表面上,该细胞被保留在孔隙中和在顶表面上。然而,这方面不能保证在体内系统,其中,所述体液围绕生物材料可以从多孔支架的期望部位拖动细胞是利用超声波刺激,这需要复杂的设备,但,促进在体外测定5的成骨细胞的标记物表达的影响。利用连续培养的需要的生物反应器,从而保证在培养基中的营养物质的均匀分布;然而,将培养的细胞的百分比显著更换培养基时,由于所使用的这种技术和介质附着到设备的壁上的流量丢失。这些问题增加了蜂窝质量所必需的这种类型的文化和时间用于获得电池7的足够数量。因此,在该工作中提出的方法表示应外推到体内系统,因为将细胞接种在微块上的顶表面材料的技术,并经过中适用吃的孵育时间,初始蜂窝质量的60%的附着。此外,这种技术不需要加入成骨细胞的电感器( 例如,地塞米松,抗坏血酸,或β-磷酸甘油)或超声刺激以诱导成骨细胞分化和维持成骨细胞表型,因为NKB是一种骨传导和骨诱导支架8,该方法对于干细胞从人类羊膜(AM-的hMSCs)大孔骨生物材料呈现在这项工作representsapossibility插入到细胞受损的骨组织,并诱导分化为成骨细胞谱系的文化。从人羊膜( 图1)中获得的干细胞表现出成纤维细胞样形态,类似于间充质细胞( 图2)并且是主要的MSC。此外,流式细胞术分析显示,这些细胞表达间充质细胞标志物(CD73,CD90,和CD105)和阴性造血谱系标记物(CD34,CD45)( 图3)。另外,在AM-的hMSCs分离在这项工作中呈现形成的CFU( 图6)的能力。类似地,间充质干细胞中分离以这种形式保留附加到osteoinductor生物材料( 图4),和增殖的支架( 图5)的能力。
由于这些原因,AM-的hMSCs的大孔骨的生物材料的培养方法,该方法是在这项工作中使用的是一个机会以插入内受伤骨组织的细胞,并诱导其各色ntiation的成骨细胞谱系。该培养系统不需要增加成骨细胞的电感器来维持成骨细胞的表型和成骨细胞分化过程,因为NKB是一种骨传导andosteoinductive材料8。利用废料的组织,如人胎盘,表示一个简单和伦理替代访问干细胞群以潜力分化为间充质干,在与其他来源经常涉及侵入性方法或低细胞产量比较。
所提出的培养方法,可以外推到体内系统,因为将细胞接种在微块的顶部表面的材料,并将细胞定居和适当的孵育时间后粘附到整个生物材料的表面上。此外,复杂的试剂,设备和程序是不需要的,不象现有的方法实施该技术时微质量cultureas以及在材料上的细胞的等分试样的缓慢而稳定的沉积,以确保细胞优先与生物材料相互作用,并且不与该板的底部。另一个关键点是在培养细胞之前用预湿的材料,因为这确保了细胞将具有从培养基中的必需营养素当它们被集成到该材料无论它们是否在表面上或微孔中。最后,因为它避免了另外的外部因素来诱导和维持成骨细胞分化的使用的骨诱导材料的是这一进程的关键。该技术的限制是,它是基于牛基质的骨诱导潜力;然而,所提出的培养系统可以外推到20至200微米的孔分布的任何多孔材料。因此,在这种工作中提出的程序是用于在各种材料吨间质干细胞培养的另一种方法帽子被用于组织工程,特别是对骨再生。
The authors have nothing to disclose.
我们承认奖学金,并由理事会全国国立西恩西亚ŸTECNOLOGIA(国家科学技术委员会No.49887),Facultad去医学设备,墨西哥国立自治大学DGAPA IN201510和DGAPA IN216213提供了资金支持;国家研究所Perinatología萨尔瓦多·科雷亚的帮助,生物材料;和Biocriss,SA德C. V捐出Nukbone。也感谢给ING。 IIM,墨西哥国立自治大学的赫克托·马丁内斯和CINVESTAV技术援助了M ENÇ法比奥拉·冈萨雷斯。
sterile phosphate buffered saline | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10010023 | cell culture |
penicillin-streptomycin | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10378016 | cell culture |
FBS | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 26140111 | cell culture |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 11965118 | cell culture |
collagenase type II | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 17101015 | cell culture |
3mM calcium chloride | SIGMA_ALDRICH | C5670 | cell culture |
trypsin/0.5mM EDTA solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | R001100 | cell culture |
Trypan Blue solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
FITC- CD90, | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
PE-CD34 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
FITC-CD45 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
PE-CD105 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Pharmigen | BD FACSCalibur | cytomery |
alamarBlue (AB) | LIFE TECHNOLOGIES | DAL1025 | proliferation cell assay |
SUNRISE-reader | TECAN, Germany | Sunrise | proliferation cell assay |