प्रोटीन गिरावट के व्यवस्थित विश्लेषण के लिए रिपोर्टर-आधारित विकास परख
Summary
Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.
Abstract
Ubiquitin-एंटीबॉडी प्रणाली (यूपीएस) द्वारा प्रोटीन गिरावट सब यूकेरियोट्स में प्रोटीन समस्थिति के लिए एक प्रमुख विनियामक तंत्र है. intracellular प्रोटीन गिरावट का निर्धारण करने के लिए मानक दृष्टिकोण प्रोटीन गिरावट के कैनेटीक्स निम्न के लिए जैव रासायनिक assays पर निर्भर करता है. इस तरह के तरीके अक्सर श्रमसाध्य और समय लगता है और कई substrates और गिरावट की स्थिति का आकलन करने के उद्देश्य से प्रयोगों को इसलिए उत्तरदायी नहीं हैं. एक विकल्प के रूप में, सेल के विकास आधारित assays मात्रात्मक प्रोटीन के स्तर में रिश्तेदार परिवर्तन का निर्धारण नहीं किया जा सकता कि उनके पारंपरिक प्रारूप, अंत बिंदु assays में, कर रहे हैं कि विकसित किया गया है.
यहाँ हम ईमानदारी से खमीर सेल विकास कैनेटीक्स उन्हें युग्मन द्वारा प्रोटीन गिरावट दरों में परिवर्तन निर्धारित करता है कि एक विधि का वर्णन. विधि URA3 की uracil auxotrophy खमीर कोशिकाओं एक exogenously व्यक्त संवाददाता प्रोटीन से बचाया है -deleted जहां एक की स्थापना की चयन प्रणाली पर आधारित हैआवश्यक URA3 जीन और एक गिरावट निर्धारक (degron) के बीच एक संलयन के शामिल. संवाददाता प्रोटीन इसकी गिरावट दर degron द्वारा निर्धारित है जबकि इसकी संश्लेषण की दर स्थिर है कि इतनी बनाया गया है. Uracil कमी मध्यम में सेल के विकास Ura3 के सापेक्ष स्तरों के लिए आनुपातिक है, विकास कैनेटीक्स संवाददाता प्रोटीन गिरावट पर पूरी तरह निर्भर हैं.
इस विधि को सही रूप से intracellular प्रोटीन गिरावट कैनेटीक्स में परिवर्तन के उपाय. (क) E2 के conjugating एंजाइम की संरचना समारोह (ग) पहचान और उपन्यास degrons के लक्षण वर्णन का विश्लेषण करती है प्रोटियोलिसिस (ख) के लिए जाना जाता ubiquitin-conjugating कारकों के सापेक्ष योगदान का आकलन: यह करने के लिए लागू किया गया था. यह भी अन्य सेलुलर रास्ते के कार्यों के साथ जुड़े प्रोटीन के स्तर की निगरानी में परिवर्तन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के रूप में degron- URA3 आधारित प्रणाली के आवेदन, प्रोटीन गिरावट क्षेत्र अतिक्रमण.
Introduction
ubiquitin-एंटीबॉडी गिरावट प्रणाली सभी यूकेरियोट्स में प्रोटीन homeostasis के रखरखाव में शामिल किया गया है जो एक प्रमुख विनियामक मशीन, है. यूपीएस शुरू में पाली ubiquitin टैग प्रोटीन 26S एंटीबॉडी द्वारा अपमानित किया जाता है, जिसके बाद एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए कई ubiquitin अणुओं conjugates. ज्यादातर मामलों में, ubiquitin मध्यस्थता गिरावट के लिए कदम सीमित दर E2 के एंजाइमों conjugating और E3 एंजाइमों ligating द्वारा मध्यस्थता सब्सट्रेट ubiquitylation, (E3 के ligases) 1 है. नतीजतन, विशिष्ट प्रोटीन के intracellular स्थिरता उनके ubiquitin-विकार के लिए संवेदनशीलता और उनके आत्मीय ubiquitylation एंजाइम की गतिविधि को दर्शाता है.
E3 के ligases यूपीएस की प्रिंसिपल सब्सट्रेट मान्यता घटक हैं. जैसे, इन एंजाइमों अनुपस्थित या उनके स्थिर समकक्षों 2 में उजागर नहीं है कि या तो उनके substrates के भीतर degrons पहचाना. सेल चक्र एम के उदाहरण के लिए, कई नियामकोंउस्त संश्लेषित और क्रम में सेल चक्र प्रगति रखने के लिए एक अस्थायी विशिष्ट ढंग से अपमानित किया. इन प्रोटीनों की गिरावट अक्सर सेल संकेत विनियमित kinases 3,4 द्वारा मध्यस्थता, फास्फारिलीकरण द्वारा नियंत्रित किया जाता है. दूसरी ओर, aberrantly-मुड़ा हुआ प्रोटीन गुप्त degrons के माध्यम से मान्यता प्राप्त हैं. ये आम तौर पर देशी संरचना में छिपे हुए हैं और संरचना गड़बड़ी पर उजागर कर रहे हैं कि क्षेत्र हैं. इस तरह degrons हाइड्रोफोबिक डोमेन 5-7 और आंतरिक रूप से अव्यवस्थित क्षेत्रों 8 शामिल हैं.
Reticulocyte lysates 9 में प्रोटीन गिरावट और इसके मूल सिद्धांतों के लक्षण वर्णन के लिए ubiquitin-प्रणाली का मौलिक खोज के बाद से, खमीर आनुवंशिकी ubiquitin प्रणाली 10 के घटकों के कई की खोज में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी. यूपीएस द्वारा प्रोटीन गिरावट के व्यवस्थित विश्लेषण के लिए एक मॉडल जीव के रूप में खमीर की सफलता यूपीएस उच्च तथ्य यह है कि मुख्य रूप से की वजह से हैly एक प्रायोगिक प्रणाली के रूप में उनके ज़िम्मा के साथ मिलकर, सभी यूकेरियोट्स 4 में संरक्षित. दरअसल, खमीर आधारित प्रणाली सामान्यतः ubiquitylation मशीनरी की कार्रवाई के तंत्र को समझने के लिए कार्यरत हैं.
जैव रासायनिक तरीकों से प्रोटीन गिरावट का अध्ययन आमतौर पर सेल के अर्क की तैयारी की आवश्यकता है. पशु सेल प्रोटीन प्रोटीन बातचीत और समारोह के संरक्षण कि अपेक्षाकृत हल्के परिस्थितियों में निकाला जा सकता है, खमीर 11 में एक मजबूत सेल दीवार की उपस्थिति प्रोटीन वसूली प्रभावित हो सकता है जो काफी कठोर विघटन की स्थिति की आवश्यकता है. दरअसल, खमीर सेल विघटन के लिए विभिन्न प्रक्रियाओं को सही ढंग से उनके रिश्तेदार सेलुलर बहुतायत का प्रतिनिधित्व करते हैं कि मात्रा में बरकरार प्रोटीन ठीक करने के लिए अपनी क्षमता में काफी भिन्नता है. इसके अलावा अशुद्धि विशिष्ट प्रोटीन की गिरावट दरों का निर्धारण करने के लिए कार्यरत विभिन्न तरीकों में निहित है: आईएम द्वारा पीछा मेटाबोलिक लेबलिंग आधारित 'पल्स-पीछा' प्रयोगोंmunoprecipitation, विशिष्ट प्रोटीन 12 अलग करने के लिए, अक्सर सख्ती से मात्रात्मक नहीं है. प्रोटीन गिरावट इस विधि से तुलना की जाती है जब इस प्रकार, अतिरिक्त सावधानी परिणामों की व्याख्या में प्रयोग किया जाना चाहिए. इस खामी को नाकाम करने के लिए, एक वैकल्पिक cycloheximide (CHX) पीछा परख 12 नियोजित किया जा सकता. इस परख में अनुवाद अवरोध बाद में निगरानी कर रहे हैं सेल संस्कृतियों और प्रोटीन स्थिर राज्य स्तर में अस्थायी परिवर्तन करने के लिए जोड़ा गया है. फिर भी, CHX का प्रयोग अपेक्षाकृत कम आधा जीवन (<90 मिनट), प्रोटीन संश्लेषण के रूप में लंबे समय तक निषेध साइटोटोक्सिक है साथ प्रोटीन के लिए सीमित है. विशेष रूप से, उपर्युक्त assays के दोनों हमेशा उपलब्ध नहीं हैं, जो प्रोटीन विशिष्ट एंटीबॉडी, के उपयोग की आवश्यकता.
इन तकनीकी सीमाओं को पार करने के लिए, शोधकर्ताओं सेल निष्कर्षण और प्रत्यक्ष प्रोटीन से निपटने की आवश्यकता नहीं है कि कई दृष्टिकोण विकसित किया है. एक दृष्टिकोण auxotrophic हाँ की स्थापना पर आधारित हैआवश्यक चयापचय एंजाइम एन्कोडिंग जीन का विलोपन द्वारा प्राप्त सेंट उपभेदों,. इस तरह के जीन OMP decarboxylase encodes कि HIS3, LEU2, LYS2 और TRP1, अमीनो एसिड जैवसंश्लेषण के लिए आवश्यक एंजाइमों के लिए एन्कोडिंग, साथ ही URA3 (Ura3), pyrimidine ribonucleotide जैवसंश्लेषण की एक आवश्यक एंजाइम शामिल हैं. Ura3 व्यापक रूप से प्रोटीन गिरावट के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है. इन assays में, Ura3 के विधान अभिव्यक्ति uracil कमी मध्यम 13 में ura3 कोशिकाओं के विकास को बचाता है. नतीजतन, एक degron के विलय के माध्यम से Ura3 को अस्थिर न्यूनतम मध्यम कमी uracil पर सेल के विकास को कम कर सकते हैं. इस विधि गिरावट की पहचान सहित विभिन्न प्रोटीन गिरावट पढ़ाई में 5 निर्धारकों इस्तेमाल किया गया है, E3 के 14 ligases और सहायक ubiquitylation 15 कारकों और उपन्यास यूपीएस degrons 16 की खोज. इन तरीकों के सभी परख readout के रूप में अगर प्लेट पर सेल के विकास कार्यरत हैं. हालांकि, टीवह विकास कसौटी (सकारात्मक / नकारात्मक वृद्धि), मजबूत और कुशल, ज्यादातर गुणात्मक है और एक degron की शक्ति या विभिन्न सहायक गिरावट कारकों के सापेक्ष योगदान का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है कि मात्रात्मक जानकारी प्रदान नहीं करता है.
इसलिए हम विकसित और फ्यूजन प्रणाली -degron URA3 द्वारा प्रोटीन गिरावट के व्यवस्थित और मात्रात्मक विश्लेषण को सक्षम करने खमीर वैक्टर और स्क्रीनिंग तरीकों का उपयोग किया है. प्रोटोकॉल चुनिंदा परिस्थितियों में तरल संस्कृति (gils) में और मानक विकास घटता की पीढ़ी पर विकास कैनेटीक्स उपाय है कि एक आसान-संभाल परख पर आधारित है. अंतराल, घातीय (प्रवेश) और स्थिर चरण – खमीर विकास कैनेटीक्स तीन मुख्य चरणों की विशेषता है. Ura3-degron की अभिव्यक्ति के स्तर से निर्धारित होता है जो चुनिंदा परिस्थितियों में लॉग चरण के दौरान खमीर प्रतिकृति कैनेटीक्स की गणना, एक निष्पक्ष मात्रात्मक माप ओ प्रदान करता हैएफ प्रोटीन गिरावट. इस विधि को मापने और एक साथ कई उपभेदों में और विभिन्न परिस्थितियों में कई यूपीएस substrates की गिरावट दरों की तुलना करने के लिए लागू किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम (gils) 'चुनिंदा परिस्थितियों में तरल संस्कृति में विकास कैनेटीक्स' करार दिया सापेक्ष प्रोटीन गिरावट दरों का निर्धारण करने के लिए सेल के विकास पर आधारित एक परख का वर्णन. इसे स्थापित करने के लिए स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma – Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma – Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma – Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma – Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96 well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma – Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used | |
| MDTcalc | Experimental software |
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