Abstract
ユビキチン - プロテアソーム系（UPS）によるタンパク質分解は、すべての真核生物におけるタンパク質ホメオスタシスのための主要な調節機構である。細胞内タンパク質分解を決定する標準的なアプローチは、タンパク質の減少の速度論に従うための生化学的アッセイに依存している。そのような方法は、多くの場合、面倒で時間がかかり、複数の基板や劣化状態を評価することを目的とした実験に、したがって適していない。別の方法として、細胞増殖に基づくアッセイは、定量的にタンパク質レベルの相対的変化を決定することができないそれらの従来のフォーマット、エンドポイントアッセイであることが、開発されてきた。
ここでは、忠実に酵母細胞増殖速度にそれらを結合することによって、タンパク質分解速度の変化を決定する方法を説明する。この方法は、URA3のウラシル要求性酵母細胞が外因的に発現されるレポータータンパク質によって救助され-deleted確立選択システムに基づいています、本質的なURA3遺伝子および分解行列式（デグ）の間の融合から成る。レポータータンパク質は、その分解速度は、デグロンによって決定され、一方、その合成速度が一定になるように設計されている。ウラシル欠損培地における細胞増殖はUra3遺伝子の相対的なレベルに比例するように、成長速度は、レポータータンパク質の分解に完全に依存している。
この方法は、正確に細胞内タンパク質分解速度の変化を測定する。 （a）は、E2結合酵素の構造と機能は、（c）の同定と新規デグロンの特性を分析し、タンパク質分解、（b）は、既知のユビキチン結合因子の相対的寄与を評価する：これは、に適用した。それはまた、他の細胞経路の機能に関連するタンパク質レベルの変化を監視するに適合させることができるようにdegron- URA3ベースのシステムの適用は、タンパク質分解フィールドを越え。
Introduction
ユビキチン - プロテアソーム分解系は、全ての真核生物におけるタンパク質恒常性の維持に関与している主要な調節機である。 UPSは、最初にポリユビキチン標識タンパク質は26Sプロテアソームによって分解された後、標的タンパク質に複数のユビキチン分子をコンジュゲート。ほとんどの場合、ユビキチン媒介性分解のための律速段階は、E2は酵素を結合させると、E3は酵素（E3リガーゼ）1を連結することによって仲介される、基質ユビキチン化である。結果的に、特定のタンパク質の細胞内安定性は、ユビキチン抱合とその同族ユビキチン化酵素の活性に対する感受性を反映している。
E3リガーゼは、UPSの主な基質認識コンポーネントです。このように、これらの酵素は、その安定した対応2で露光存在しないかのいずれかであるそれらの基質内デグロンを認識する。細胞周期mの例えば、多くの規制当局USTのために細胞周期の進行を維持するために一時的に特定の方法で合成され、分解される。これらのタンパク質の分解は、多くの細胞シグナル調節キナーゼ3,4によって媒介されるリン酸化によって制御される。一方、異常に折り畳まれたタンパク質は、不可解なデグロンを通じて認識される。これらは通常、天然の構造に隠されていると構造摂動時にさらされている領域である。このようなデグロンは、疎水性ドメイン5-7と本質的に無秩序セグメント8が含まれています。
網状赤血球溶解物9でのファンダメンタルズのタンパク質分解および特性のためのユビキチンシステムの独創的発見以来、酵母遺伝学は、ユビキチンシステム10の構成要素の多くを発見に尽力した。 UPSによるタンパク質分解の体系的な分析のためのモデル生物として酵母の成功は、UPSが高いという事実に主に起因しているLyは実験システムとしての従順と相まって、すべての真核生物において保存4。実際、酵母ベースのシステムは、一般的にユビキチン化機構の作用メカニズムを解読するために使用される。
生化学的手段によってタンパク質分解を研究することは、通常、細胞抽出物の調製を必要とします。動物細胞タンパク質、タンパク質相互作用及び機能を維持する比較的穏やかな条件下で抽出することができるが、酵母11ロバスト細胞壁の存在は、タンパク質の回収に影響を与える可能性がかなり厳しい破壊条件を必要とする。実際、酵母細胞破壊のための異なる手順が正しく、それらの相対的な細胞豊かさを表す量で完全なタンパク質を回復する能力がかなり異なる。さらに不正確さは特定のタンパク質の分解速度を決定するために使用されるメソッドの違いに固有のものである：イム続く代謝標識ベースの「パルスチェイス」実験munoprecipitation、特異的タンパク質12を単離するために、多くの場合、厳密に定量的ではない。タンパク質の分解は、この方法によって比較されたときにこのようにして、余分な注意が結果の解釈に注意すること。この欠点を回避するために、代替のシクロヘキシミド（CHX）追跡アッセイは、12を用いることができる。このアッセイでは、翻訳阻害剤は、細胞培養物に添加し、タンパク質の定常状態レベルの時間的変化は、続いてモニターされる。タンパク質合成の長期の阻害は、細胞傷害性であるようにもかかわらず、CHXの使用は、比較的短い半減期（<90分）を有するタンパク質に限定される。注目すべきことに、上記のアッセイの両方が常に利用可能でないタンパク質に特異的な抗体の使用を必要とする。
これらの技術的限界を克服するために、研究者は、細胞抽出と直接タンパク質の処理を必要としないいくつかのアプローチを開発しました。 1つのアプローチは栄養要求まことにの確立に基づいています必須の代謝酵素をコードする遺伝子の欠失によって得られる目株。このような遺伝子は、OMPデカルボキシラーゼをコードHIS3、LEU2、LYS2およびTRP1、アミノ酸生合成に必要な酵素のための符号化、並びにURA3（のUra3）、ピリミジンリボヌクレオチド生合成の重要な酵素が含まれる。 URA3広くタンパク質分解の研究で使用されている。これらのアッセイでは、のUra3の構成的発現は、ウラシル欠損培地中で13 URA3細胞の増殖を救出。その結果、デグロンの融合を通してのUra3を不安定するとウラシルを欠く最小培地で細胞増殖を減少させることができる。この方法は、劣化の識別を含む、様々なタンパク質分解研究で5決定基に使用されている、E3は14リガーゼ補助ユビキチンは15因子および新規UPSのデグロン16の発見。これらの方法の全ては、アッセイの読み出しとして、寒天プレート上の細胞増殖を用いた。ただし、tは彼の成長基準（ポジティブ/ネガティブの成長）、堅牢で効率的な、ほとんどが定性的であるとデグの効力または種々の補助劣化要因の相対的寄与を評価するために重要である定量的情報を提供していませんしながら。
そこで開発され、融合系-degron URA3によるタンパク質分解の体系的かつ定量的な分析を可能にする酵母ベクターおよびスクリーニング方法を利用している。プロトコルは、選択的条件下で液体培養物（GILS）および標準的な増殖曲線の生成に成長速度を測定扱いやすいアッセイに基づいている。ラグ、指数（対数）と固定相 - 酵母増殖動態は、3つの主要な相によって特徴づけられる。のUra3-デグロンの発現のレベルによって決定される選択条件下で対数期、中酵母複製動態の計算は、公平な定量的測定oをを提供fはタンパク質の分解。この方法は、複数の株に同時に複数のUPS基質の分解速度を測定し、比較することと、様々な条件の下で適用することができる。
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Protocol
1.細胞培養
- （a）は、URA3 -degron融合プラスミドの選択および維持のために、（b）は、付加的な代謝マーカーを含むプラスミドと、そのようなTry467（ 表2）のような適切な栄養要求性酵母細胞を形質転換する。
注：適切なプラスミドの例はYDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-URA3（LYS2）（Deg1- UV）である。これはDeg1の含む融合タンパク質を含有する酵母組込みプラスミドである-酵母転写に由来しデグロン。係数MAT2 17、FLAGエピトープ-安定ERタンパク質、およびURA3 15,18（ 図3A） -イムノブロッティング、Vma12による検出。 （この研究でかつ適切なプラスミドのその他の例に用いられたプラスミドについては、表3を参照してください。） - プラスミドの選択および維持のために、アミノ酸の選択マーカーを欠いた適切な定義合成（SD）培地の下で寒天プレート内の細胞を保つ
- 定常期に達するまで、プラスミド維持のための適切な選択SD培地で30℃で細胞をO / Nを成長させる。検査されるべきサンプルの数（セクション2）に応じて、試験管内または96ウェルプレートに細胞を増殖させる。
分析のための2.細胞調製
- サンプル（N≤15）の少数をアッセイする場合には、細胞を希釈し、以下のように培地を交換する。
- 96ウェルプレート（透明底）にウェルあたりSD培地150μlでO / N培養から細胞50μlを希釈する。ブランクは、培地のみを含むもので注意、最初のサンプルが指定される。
- マイクロプレートリーダーを用いて96ウェルプレート中の試料のOD 600値を決定します。
- WHから、希釈係数（×4）でOD 600読み取り値を乗算することにより、各ウェル内の実際のOD 600を計算するICH空白読書の値が減算される。ランベルト·ベールの法則に従って計算さ1cmの経路長を得るために、0.55で割ることによって得られた値を正規化する。標準的な96ウェルプレート中の細胞を200μlのOD 600を測定する際に注意し、この値は一定である。
- 0.25のOD 600を 、エッペンドルフチューブに移すために相当する量で、酵母細胞を得るために必要な正確な量を計算する。
- 1分間、高速（12000×gで）で細胞をスピンダウン。
- 0.25のOD 600を得るために、（セクション3.1を参照）上清を除去し、適切な選択培地の1ミリリットル中に細胞を懸濁します。
- 96ウェルプレート中の新しいウェルに希釈された菌株の200μlのを転送します。
- サンプル（N> 15）の多数は、試験しようとする場合、細胞を希釈し、以下のように、前のOD 600を測定することなく、培地を交換する。
- 静止細胞の10μlのを転送（セクション3.1を参照）、適切な選択培地190μlの（希釈1:20）を含む新しい96ウェルプレートに96ウェルプレートに、O / Nで増殖させた。
選択条件下で液体培養3.成長動態（GILS）
- のUra3-デグロンレポーターを用いた成長測定のために、次のメディアを使用します。
- 非制限的な条件の下で酵母増殖のポジティブコントロールのための、（セクション1.2を参照）、プラスミドの選択SDメディアを使用しています。ないプラスミドの選択が必要でない場合、例えば、Deg1 -UV、必要なすべてのアミノ酸（完全なSD）を含有するSD培地として組込みプラスミドを使用するときに使用することができる。
- 制限された条件下での増殖を測定する実験試料については、SD-URA培地を使用しています。
- マルチモードマイクロプレートリーダーの設定：15分間30℃で、OD 600の測定間隔のインキュベーション温度、1分毎に7分の軌道と線形振盪サイクル<BR />注：このデュアルモード揺れ、細胞の均一な分布が得られるように最適化された。しかし、他の揺れモードやさえなしに振とうも同様に動作する可能性があります。
- 30℃で細胞をインキュベートし、マイクロプレートリーダーO / Nまたは細胞が静止期（12~24時間）に達するまで。
- スプレッドシートファイルに生データをエクスポートします。
- （;詳細はセクション4を参照するための最小限の倍加時間（MDT））細胞がその人口規模を倍増するためのMDTcalc、（時間で）最小限の時間を計算し、カスタマイズされたソフトウェアプログラムを使用して、酵母の増殖速度を決定する。
最小限の倍加時間（MDT）4.計算：MDTcalcアルゴリズムの原則
NOTE：MDTcalcアルゴリズムの原理は、SD完全培地中で増殖させTry467酵母細胞（ 表2）の代表的なサンプルを使用して、データスプレッドシート、および成長のプロットを示し、 表1および図1に示されている、のrespectively。
- サンプルウェルで得られた測定値のそれぞれから、それぞれのウェルにおいて得られたOD 600空白値を、減算します。 0.55によって得られた差分を分割する（96ウェルプレートの場合）の光路長を補正する。最終的な値（ 表1、トランス）プロット時間に対して実際の酵母増殖曲線（OD 600 /時間）（ 図1A）を生成する。
- 非線形曲線（ 図1B）に対数増殖期に変換するために変換された値のそれぞれについてのlog 2（OD 600）を計算する。
- 時間0で開始し、N <10（; 図1C、表1、スロープ）まで、一度に一つの時点を移動する10の時点間隔の傾きを算出する（N = 10）。
- 倍増する細胞集団に要する時間が取得する各傾きの逆数の値を計算した（ 表1、1 /勾配; 図1C）。最小限の計算MDT（; 図1C、表1、黒い四角形）を決定する1 /スロープ値。選択された時間間隔からのサンプル中の細胞（ 表1、1 /スロープ、黒い四角形）について計算MDTを抽出する（赤い矩形によって概説表1、1B、1D図 ）。
NOTE：SD-URA培地上での細胞増殖の速度は、MDTに反比例する。
5. MDTcalcの使い方
- コンピュータ内の指定したフォルダに補充プログラムファイルをコピーします。
- 成長データを含むスプレッドシートファイルを保存して閉じていることを確認してください。スタート画面が表示されます確認するMDTcalcアプリケーションプログラムを開きます。
- 図2に示されているように、必要な情報を挿入します。
- 「ファイルパス 'の下では、スプレッドシートファイルを検索するために右の四角形をクリックしてください。
- ここで、t 'シート名'の下では、スプレッドシートの名前を書く生データが置かれている彼。
- 「開始位置」の下では、スプレッドシートが最初のサンプルの時間0の座標挿入します。
- 「時間列」の下では、時点カラム（時間は秒単位で提供されるべきである）の場所を定義する文字を挿入します。
- 「空白列 'の下では、空欄（通常は必ずしもそうではない中で96ウェルプレートのA1）の場所を定義する文字を挿入します。
- 「OD値」の下では、MDT計算（通常は0.15〜0.25）の開始に必要な最小限の変換されたOD 600値を選択します。 MDTのみ定義さOD 600値以上に達した試料について計算されるように、この値を設定すると、過剰な希釈のラグフェーズにおける培養のためのMDTの計算を防止する。
- 最後の値が入力されると、画面の下部にある「計算」ボタンを押してください。右側のプログレスバーが徐々にgまで変化していることを確認してくださいREEN。計算プロセスの間、スプレッドシートファイルを開かないでください。
- スプレッドシートにMDT計算の完了時に画面上に自動的に表示されたデータの2セットをエクスポートします。最小限のOD値試験に合格するために、各ウェルの（a）MDT値（セクション5.2.1.6に設定されたように）とMDTを算出し、そこから間隔の（b）は、初期時点（スタート：データが含まれていることを確認時間）。
- 図2に示されているように、必要な情報を挿入します。
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Representative Results
レポーター基質の分解にDoa10経路の酵素の役割を調査する
それは伝統的な分解アッセイと比較したGILS方法の妥当性をテストするには。この実験は、ER-膜の成分の相対的な寄与を評価するローカライズされたタンパク質の品質管理レポーター基質Deg1- VU（ 図3A）の分解に対して20,21複雑Doa10 E3リガーゼ。 Deg1- VUプラスミドは、 野生型細胞に、またはその後にCHXチェイスアッセイ6により決定されたE2結合酵素、UBC7（UBC7）及びタンパク質の安定性のための遺伝子を欠く細胞に組み込まれた。抗FLAGイムノブロットは、 野生型細胞 （ 図3B）には存在しなかったUBC7細胞において安定Deg1 -vuタンパク質バンドを明らかにした。 野生型細胞におけるDeg1 -vuの不在はattribuあるDeg1 -vu安定性がUBC7に強く依存していることを示す、UBC7細胞に廃止された、その継続的な劣化に対してテッド。
明らかに、Deg1- VUの劣化が急速である。タンパク質は、最初から、野生型細胞では検出不能であるので、分解の相対速度は、CHXアッセイによって決定することができない。このため、新たに開発されたGILSアッセイ法は、野生型および種々の変異株（ 図3C）との間のタンパク質分解の速度論における相対的差異を比較するために、使用した。当初は、Deg1 -vuを表現する野生型、UBC6、UBC7またはdoa10細胞は、SD完全培地上で生育させた。 GILSを測定するために、細胞を洗浄し、SD-URA中でインキュベートした。プロトコルに例示されるようにMDT計算が実行された。 図3C、3Dは、同様の増殖曲線を示して、完全なSDで成長させたすべての株についてMDT（〜2.5時間）を算出し、excludingの調べた遺伝子のいずれかの欠失が細胞増殖に影響を与える可能性。わずかな成長欠損変異株（MDT〜3時間）で観察されたのに対し、対照的に、SD-URAでのインキュベーションは、 野生型細胞 （MDT = 6.34）の成長不良をもたらした。
Deg1- VUの劣化にE2結合酵素UBC7の異なる変異体の影響を調べる
システムの実験的な範囲が非常に広いためUBC7は絶対にDeg1- VU分解に必要であるという事実は、さまざまなE2変異体の場合でも部分的な効果の正確な評価を可能にします。したがって、 野生型または変異UBC7を含むプラスミドはDeg1 -vuを表現UBC7細胞に統合され、劣化への寄与はGILSにより決定した。予想通り、速い成長速度は、活性部位μとUBC7を発現する細胞において観察されたtants C89SとN81A 22（ 図4）。さらに、2つの変異体は、間接的にDeg1 -vu劣化（V25GおよびH94K）が試験された妨害すると予測。これらの突然変異はまた、（V25GおよびH94K 3.4時間の平均のMDTはC89SおよびN81K 2.7時間の平均のMDTと比較して）（ 図4にもかかわらず、活性部位変異体より少ない程度に、 野生型 UBC7と比較して、細胞増殖を増強）。したがって、GILS方法はレポーター基質の安定性に対する様々な劣化要因の相対的な寄与を正確に測定するために使用することができる。
小説デグロンの単離と評価
GILSシステムはまた、 すなわち 、それらは分解（ 図5）を誘導することにより度を新規デグロンを特定し、それらの相対的効力を定量するための高スループットスクリーニングフォーマットで使用した。 、追加の善意デグロンの識別を最適化するために、フルオロオロト酸（5-FOA）の存在下での成長である選択ステップは、添加した。 URA3が効率のUra3が16,23不安定化する酵母菌株の単離のための正の選択としての役割を果たすことができる毒性化合物（5-フルオロウラシル）に5-FOAに変換します。新規デグロンを特定するために、レポータープラスミドのライブラリーは、URA3-GFPプラスミド24（ 図5A）、酵母cDNAライブラリーから誘導されたランダムな断片を融合することによって作製した。 GFP部分は（議論を参照）融合デグロンの局在についての情報を二次スクリーニングを有効にして提供するために追加されました。ライブラリーは、5-FOA（ 図5B）、陽性クローンの存在下で選択し、酵母を形質転換し、単離し、96ウェルプレートフォーマットで寒天プレート上に再播種した。セクション2.2で説明したように各コロニーを新しい96ウェルプレートに、96ウェルプレートに移し、O / Nインキュベートし、希釈した。これは、SD-URA培地中の細胞の成長が期待されているデグロンの効力の結果が分解を誘導することのUra3発現の程度と相関する。これは、その後GILS（ 図5C）を適用することにより確認した。我々は、5-FOAを事前に選択されたすべての無作為に厳選されたコロニーはSD-LEU培地（ 図5C、空のバー）で、同様のMDT値を示したことを確認した。対照的に、全てのクローンは、コントロールのUra3-GFPを（データ図示せず）を発現する細胞よりも有意に遅かったSD-URA、可変成長率を示した。指摘したように、SD-URAとMDT上の成長速度との間には逆の関係にある。従って、MDTが高く、より強力でデグロンある。確かに、積極的に選択されたクローンから派生したすべてのMDTは、コントロール（赤線の上）（ 図5C、満たされたバー）のそれよりも高かった。
<強い>テーブル酵母MDT。 時間単位の計算の1。イラストは時間（hr）である。 ブランクとサンプルのOD 600からのものである読み込みます。 変換 （トランス）、ブランク減算と路長補正後のOD 600の値です。 ログイン図2に示すように変換されたデータから計算される。 スロープログ 2（OD 600）の時間で割った10の時点の間隔の連続した内の値である1 /スロープが自分自身を複製する細胞集団に要する時間である。 黒い矩形は MDTマーク値。 赤の矩形は 、MDTを計算した、そこから時間間隔をマークします。
| 酵母 | 遺伝子型 | ソース |
| TRy467 | α、his3Δ1、lys2Δ0、ura3Δ0、leu2Δ; 0 | EUROSCARF |
| TRy508 | α、HIS3-Δ200::あるpRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS、leu2-3,112、ura3-5、lys2-801 :: MET25-Deg1-FLAG-Vma12-URA3 :: LYS、trp1-1、UBC7 Δ:: LEU2 | この研究 |
| TRy528 | α、HIS3-Δ200::あるpRS303 / Ubc7prom-UBC7 [N81A] -3HA :: HIS、leu2-3,112、ura3-5、lys2-801 :: MET25-Deg1-FLAG-Vma12-URA3 :: LYS、trp1- 1、ubc7Δ:: LEU2 | この研究 |
| TRy530 | α、HIS3-Δ200::あるpRS303 / Ubc7prom-UBC7 [C89S] -3HA :: HIS、leu2-3,112、ura3-5、lys2-801 :: MET25-Deg1-FLAG-Vma12-URA3 :: LYS、trp1- 1、ubc7Δ:: LEU2 | この研究 |
| TRy532 | α、HIS3-Δ200::あるpRS303 / Ubc7prom-UBC7 [H94K] -3HA :: HIS、leu2-3,112、ura3-5、lys2-801 :: MET25-Deg1-FLAG-Vma12-URA3 :: LYS、trp1- 1、ubc7Δ:: LEU2 | この研究 |
| TRy556 | α、HIS3-Δ200::あるpRS303 :: HIS、leu2-3,112、ura3-5、lys2-801 :: MET25-Deg1-FLAG-Vma12-URA3 :: LYS、trp1-1、ubc7Δ:: LEU2 | この研究 |
| TRy563 | α、HIS3-Δ200::あるpRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS、leu2-3,112、ura3-5、lys2-801 :: MET25-Deg1-FLAG-Vma12-URA3 :: LYS、trp1-1、UBC7 Δ:: LEU2、ubc6Δ:: KanMX | この研究 |
| TRy633 | α、HIS3-Δ200::あるpRS303 / Ubc7prom-UBC7 [V25A] -3HA :: HIS、leu2-3,112、ura3-5、lys2-801 :: MET25-Deg1-FLAG-Vma12-URA3 :: LYS、trp1- 1、ubc7Δ:: LEU2 | この研究 |
| TRy786 | α、HIS3-Δ200::あるpRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS、leu2-3,112、ura3-5、lys2-801 :: MET25-Deg1-FLAG-Vma12-URA3 :: LYS、trp1-1、UBC7 :: LEU、doa10Δ:: HIS3 | この研究 |
この研究で使用された酵母株の表2にリスト。
| この研究で使用したプラスミド | ||
| プラスミド | 関連するマーカー | ソース |
| pTR717 | YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-URA3（LYS1を含む組込みプラスミド） | この研究 |
| pTR1412 | pRS315-CUP1p-URA3-HA-GFP（LEU） | この研究 |
| さらなる適切なレポータープラスミド | ||
| プラスミド | 関連するマーカー | ソース |
| pOC9-CL1は | pOC9-CUP1p-HA-URA3（TRP1） | （17） |
| URA3-2（GFP） | pPS414-TRP1p-MYC-ura3-2-GFP | ルイスとペルハム |
本研究で使用したプラスミドの表3.リスト ·リファレンス：ルイス、MJ＆ペルハム、形質膜上感熱タンパク質のHR非効率的な品質管理PLOS ONE 4、e5038、DOI：10.1371 / journal.pone.0005038（2009）。
MDTの計算1.原則図 。 OD 600 0.22でTry467酵母細胞は、指示された時間期間の間、SD完全培地中でインキュベートした。 OD 600の測定値は、すべて〜15分を採取し、データをスプレッドシートに収集した。 （A）表1から形質転換されたOD 600値を時間に対してプロットした。 （B）。OD 600の2は時間に対してプロットレッドラインをログ：MDTを算出した、そこから時間間隔（D）をマークします。 （C）酵母成長率（傾き）は、経時的に連続した10の時点（仮定して直線性）のOD 600の変化を測定することにより計算された開始時間 ：計算が開始された時刻。 。計算された最小倍加時間（時間で）：（D）は、酵母が倍増するのに要する時間は、（C）（1 /スロープ）MDTからの傾きの逆数である。
図2.画面を起動MDTcalc：プロトコルセクション5.1。典型的な入力値が示されて入力される。
UBC7変異株におけるDeg1 -vuの相対的分解速度の測定図4.左：対時間変換されたW ILD型のレプリケーション中に測定されたOD 600値は、UBC7のΔと示さUBC7変異体のプロット、。 Deg1 -vuを発現する細胞をSD-URA培地上で増殖させ、OD 600は、各〜15分間測定した。右：各菌株のためのMDTがMDTcalcを用いて計算した。
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図5の新規デグロンの同定および単離するためのハイスループットアッセイ 。 （A）のUra3-GFP-cDNAのレポーターの特徴の概略プレゼンテーション。 （B）デグロンを有する酵母菌株を単離するための実験手順を説明するフローチャート。 Aに記載のプラスミドライブラリーは、SD-LEUプレート上で選択し、続いてTry467細胞に形質転換した。コロニーは、5-FOAを含むSD-LEUプレートに複製され、急成長しているコロニーを命じ、アレイ内のプレート上に集め、組織された。 （C）コロニーを、SD-LEUまたはSD-URA 20時間のためのメディアのどちらかでインキュベートした5-FOAを含有するプレート上で増殖したUra3-GFP-cDNAを発現する。 OD 600が MDTcalcソフトウェアを用いて計算したあらゆる〜15分であり、最小の酵母倍加時間（MDT）が測定されなかった無デグロンを ：デグロンなしのUra3-GFPを発現するプラスミドを、グラム陽性対照として機能するowth 赤い線 ：コントロールのMDT値によって決定された閾値。
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Discussion
ここでは、相対的な蛋白分解速度を決定するための細胞増殖に基づくアッセイを記載し、（GILS） '選択的条件下で液体培養での成長速度」と呼ばれる。 、これは、セットアップが簡単で、データ収集および解析は、簡単であり、それは非常にモジュール化されている：GILSアッセイは、いくつかの利点を有する。したがって、GILSハイスループットアプリケーションのための自動化に適応させることができる、ユーザフレンドリーなマルチウェルプレート形式で複数のサンプルを同時に適用することができる。最も重要なことは、GILSは非常に、再現性の定量的かつ堅牢なデータを提供し、陽性/陰性の増殖について選択寒天プレートに基づく成長アッセイよりも柔軟性があります。また、GILSは、関連するUPSコンポーネントまたはデグロンの活性を反映して、タンパク質分解速度または定常状態レベルの小さな変化を検出できるように非常に敏感である。最後に、GILSアッセイはgrowtと比較して有意に短い成長期（<12時間）を必要とする寒天プレート上の時間アッセイ（通常は2~4日）。
GILSアッセイは、タンパク質分解を研究するために非常に有用であるが、いくつかの重要な考慮事項が考慮されるべきである。例えば、株特異的増殖特性に起因する同質遺伝子の酵母株バックグラウンドを使用することが不可欠である。さらに、アッセイの有効性を確認するために、各アッセイは同一の条件下で少なくとも3回繰り返されるべきである、最も重要なのは、最初の細胞密度（OD 600）、成長温度、及び細胞培養、振とう強度が変更されるべきではない。したがって、特定のアッセイプロトコールを繰り返す用途にマイクロプレートリーダーのソフトウェアに格納されていることをお勧めします。デグロンはUra3遺伝子内に位置する場合考慮すべき付加的な変数である。デグロン位置がその機能を決定することができるように、C 'またはN'領域のいずれかでの位置決めが経験的にテストする必要があります。
レポーターPROTのキャリブレーションEINの発現レベルもGILSの適用が成功するために重要である。最適な記者が効率的に調査中のシステムにより分解されるものであるため、ウラシル要求性を付与する。しかし、栄養要求性の変化も忠実にレポーターの安定性を反映する必要があります。これはGILS（ 図3B）によって決定前に付加的な生化学的方法によって決定されたレポータータンパク質の分解速度との相関関係のテスト、MDT値によって経験的に決定することができる。 1つの共通の問題は、レポーターの基底定常状態発現が閾値レベルに達していない場合に発生し、それが完全に安定化されていてもSD-URA上での増殖を可能にすることが低すぎる。このような問題は、劣化に影響を与えることなく、基底タンパク質の発現を増加させる、誘導性プロモーターの制御下でレポーター発現を配置することによって克服することができる。このようなシステムにおけるプロモーター活性を細かくによるHIGをSD-URA永久成長を回避するためにキャリブレーションを行う必要がありhのタンパク質レベルを、それが部分的に分解されていても、レポーター酵素活性。それらは、タンパク質発現の高感度調節を可能にするため、この研究において記載プロモーターおよび発現条件を選択した：MET25pおよびCUP1 p は 、細かくした（ 表3）は、それぞれ、メチオニンおよび銅を制御することにより調整することができるその活性代謝産物誘導性のプロモーターである。
（本研究に記載されているものなど）、品質コントロールレポーター基質は、URA3を封鎖し、その機能を妨げる可能性の細胞内凝集体を形成することができる。このような場合、ウラシル要求性が誤ってタンパク質分解の結果として解釈することができる。集約する異なるデグロンの傾向を試験するために、追加のレポーターを使用すべきである。たとえば、デグロン画面（ 図5A）用に設計されたのUra3-GFPレポーターは、presaの複数形で成長する細胞の蛍光顕微鏡による細胞内凝集体の可視化を可能に5-FOAのNCE。これらの凝集体は明らかに可溶性タンパク質の拡散外観から識別可能であるような高密度のGFP病巣が現れた（データは示さず）。のUra3-GFP-デグロンレポーターは、同様に、タンパク質の共局在および細胞内分布にデグロンの効果を決定するために用いることができる。また、二次スクリーン25として、フローサイトメトリーによる選択された基質の分解を以下のために使用することができる。
GILS法の最も重要な利点は、それが十分に柔軟であるため、容易に、本明細書に記載したものに加えて種々の用途に適合させることができるということである。例えば、この方法は、様々な条件下で、プロテアソームの適合性を調べるために使用することができる。この場合、非ユビキチンプロテアソーム基質オルニチンデカルボキシラーゼ（ODC）のUra3遺伝子に融合されるよう。特定の局在化シグナルを用いた場合に本方法はまた、異なる細胞内コンパートメントにタンパク質分解を試験することができる。本研究ではVma12は、ER-膜（ 図3、図4）にレポーターをアンカー。同様に、核局在化シグナル（NLS）、ER保持シグナル（KDEL）または細胞質ゾル（特定の信号が存在しない）を使用することができる。様々な細胞内区画におけるタンパク質分解の同時分析を可能にするシステムは、タンパク質分解ネットワークがどのように動作するかについての我々の理解に大きな影響を与える可能性があります。最後に、選択方法の原理は、生存のためのURA3遺伝子産物を必要とするこれらの全てのヒト細胞への細菌から、他のモデル細胞ベースの系におけるタンパク質分解の研究に適用することができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma - Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma - Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma - Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma - Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96-well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma - Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used. | |
| MDTcalc | Experimental software |
References
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