Abstract
Proteinnedbrytning av ubiquitin-proteasomsystemet (UPS) är en viktig regleringsmekanism för protein homeostas i alla eukaryoter. Standarden metod för att fastställa intracellulär proteinnedbrytning beroende av biokemiska analyser för att följa kinetiken för protein nedgång. Sådana metoder är ofta arbetskrävande och tidskrävande och därför inte kan bli föremål för experiment som syftar till att utvärdera ett flertal substrat och nedbrytningsförhållanden. Som ett alternativ, har celltillväxtbaserade analyser utvecklats, som är i sina vanliga format, end-point-analyser som inte kan kvantitativt bestämma relativa förändringar i proteinnivåer.
Här beskriver vi en metod som troget bestämmer förändringar i proteinnedbrytningshastigheter genom att koppla dem till jästcelltillväxt kinetik. Metoden bygger på en etablerad urvalssystem där uracil auxotrofi av URA3 -deleted jästceller räddas av en exogent uttryckta rapportprotein, Som består av en fusion mellan den essentiella URA3-genen och en determinant nedbrytning (degron). Reporterproteinet är utformat så att dess synteshastighet är konstant medan dess nedbrytningshastighet bestäms av degron. Som celltillväxt i uracil-defekta mediet är proportionellt mot de relativa nivåerna av Ura3, tillväxt kinetik är helt beroende av nedbrytningen reporterproteinet.
Denna metod mäter noggrant förändringar i intracellulära proteinnedbrytnings kinetik. Det användes till: (a) Att bedöma den relativa betydelsen av kända ubiquitin-konjugera faktorer för proteolys (b) E2 konjugera enzym struktur-funktionsanalyser (c) Identifiering och karakterisering av nya degrons. Tillämpning av degron- URA3 -baserad systemet överskrider området proteinnedbrytning, eftersom den också kan anpassas till att följa förändringar av proteinnivåer är associerade med funktioner av andra cellulära reaktionsvägar.
Introduction
Systemet ubiquitin-proteasom nedbrytning är en viktig reglerande maskin, som har varit inblandad i upprätthållande av protein homeostas i alla eukaryoter. UPS konjugat ursprungligen flera ubiquitin molekyler till ett målprotein varefter poly-ubiquitin-märkta proteinet bryts ned av 26S proteasomen. I de flesta fall är det hastighetsbegränsande steget för ubiquitin medierad nedbrytning substrat ubiquitylation, förmedlad av E2 konjugera enzymer och E3 ligering enzymer (E3 Ligaser) 1. Följaktligen intracellulär stabilitet av specifika proteiner återspeglar deras mottaglighet för ubikitin-konjugering och aktiviteten av deras besläktade ubiquitylation enzymer.
E3 ligaser är de huvudsakliga substratigenkännings komponenter i UPS. Som sådana dessa enzymer erkänner degrons inom sina substrat som antingen är frånvarande eller inte exponerat i sina stabila motparter 2. Till exempel har många regulatorer av cellcykeln must syntetiseras och bryts ned på ett temporalt specifikt sätt för att hålla cellcykelprogression i ordning. Nedbrytningen av dessa proteiner är ofta kontrolleras av fosforylering, förmedlad av cellsignalering reglerade kinaser 3,4. Å andra sidan, är felaktigt över veckade proteiner erkännas genom kryptiska degrons. Detta är regioner som normalt är dolda i det ursprungliga strukturen och är utsatta på strukturen störning. Sådana degrons innefattar hydrofoba domäner 5-7 och i sig störda segment 8.
Eftersom det nyskapande upptäckten av ubiquitin-system för proteinnedbrytning och karakterisering av dess grunder i retikulocyt lysat 9, jästgenomiken bidrog upptäcka många av komponenterna i ubiquitin systemet 10. Framgången med jäst som modellorganism för systematisk analys av proteinnedbrytning av UPS beror främst på det faktum att UPS är högly konserverade i alla eukaryoter 4, i kombination med deras mottaglighet som ett experimentellt system. I själva verket är jästbaserade system som vanligtvis används för att dechiffrera mekanismerna för verkan av ubiquitylation maskiner.
Studera proteinnedbrytning genom biokemiska metoder kräver oftast beredning av cellextrakt. Medan djurcellproteiner kan utvinnas under relativt milda betingelser som bevarar protein interaktioner och funktion, förekomsten av en robust cellvägg i jäst 11 kräver betydligt hårdare störningsförhållanden som kan påverka proteinutvinning. Faktum är olika förfaranden för cellstörningar jäst varierar avsevärt i deras förmåga att återhämta sig intakta proteiner i mängder som korrekt representerar deras relativa cellulära överflöd. Ytterligare felaktighet är inneboende i de olika metoder som används för att bestämma nedbrytningshastigheten av specifika proteiner: Metabola märkning baserade "puls-chase" experiment följt av immunoprecipitation, för att isolera specifika proteiner 12 är ofta inte strikt kvantitativa. Så när proteinnedbrytning jämförs med denna metod, extra försiktighet bör iakttas vid tolkning av resultaten. För att kringgå denna nackdel, kan en alternativ cykloheximid (CHX) chase-analysen användas 12. I denna analys är översättningen inhibitor sattes till cellkulturer och tidsmässiga förändringar i protein steady state-nivåerna därefter övervakas. Ändå är användningen av CHX begränsad till proteiner med relativt korta halveringstider (<90 min), så långsiktig hämning av proteinsyntesen är cytotoxiskt. Noterbart är båda av de ovan nämnda analyser kräver användning av proteinspecifika antikroppar, som inte alltid är tillgängliga.
För att övervinna dessa tekniska begränsningar, har forskare utvecklat flera metoder som inte kräver cell utvinning och direkt hantering protein. Ett tillvägagångssätt är baserat på inrättandet av auxotrof jast stammar, erhållna genom strykningen av gener som kodar för viktiga metaboliska enzymer. Sådana gener inkluderar HIS3, LEU2, LYS2 och TRP1, kodning för enzymer som krävs för biosyntes aminosyra, samt URA3 som kodar OMP dekarboxylas (Ura3), ett viktigt enzym i pyrimidin ribonukleotid biosyntes. Ura3 har använts i stor utsträckning proteinnedbrytningsstudier. I dessa analyser, konstitutivt uttryck av Ura3 räddar tillväxten av URA3-celler i uracil-defekta mediet 13. Följaktligen kan destabilisera Ura3 genom fusion av en degron minska celltillväxt på minimalt medium som saknar uracil. Denna metod har använts i olika proteinnedbrytningsstudier, inklusive identifiering av nedbrytningsbestämningsfaktorer 5, ligas E3 14 och hjälp ubiquitylation faktorer 15 och upptäckten av nya UPS degrons 16. Alla dessa metoder som används celltillväxt på agarplattor som analys utläsning. Emellertid tHan tillväxtkriterium (positiv / negativ tillväxt), medan robusta och effektiva, är mestadels kvalitativ och inte ger kvantitativ information som är viktig för att utvärdera ett degron potens eller den relativa betydelsen av olika hjälpnedbrytningsfaktorer.
Vi har därför utvecklat och utnyttjat jästvektorer och screeningmetoder som möjliggör en systematisk och kvantitativ analys av proteinnedbrytning av URA3 -degron fusionssystemet. Protokollet är baserat på en enkel-till-handtaget analys som mäter Tillväxt kinetik i flytande odling under selektiva betingelser (GILS) och på generering av standardtillväxtkurvor. Jäst tillväxt kinetik kännetecknas av tre huvudfaser - eftersläpning, den exponentiella (log) och den stationära fasen. Beräkning av jästreplikerings kinetik under log-fasen under selektiva betingelser, som bestäms av nivåerna av uttryckning av URA3-degron, ger en objektiv kvantitativ mätning of proteinnedbrytning. Denna metod kan tillämpas på att mäta och jämföra nedbrytningshastigheter på flera UPS-substrat samtidigt i flera stammar och under olika förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellkultur
- Omvandla lämpliga auxotrofa jästceller, såsom Try467 (tabell 2), med en plasmid innehållande (a) en URA3 -degron fusion och (b) en ytterligare metabolisk markör för plasmid urval och underhåll.
OBS: Ett exempel på en lämplig plasmid är YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) Detta är en jäst integrerande plasmid innehållande ett fusionsprotein innefattande av Deg1 - en degron härledd från jäst transkription. faktor Mat2 17, FLAG-epitop - för detektering genom immunblotting, Vma12 - en stabil ER protein och Ura3 15,18 (figur 3A). (Se tabell 3 för plasmider som används i denna studie och för ytterligare exempel på lämpliga plasmider.) - För plasmid urval och underhåll, hålla celler i agarplattor under ett lämpligt syntetiskt Defined (SD) medium som saknar aminosyraselektionsmarkörer
- Odla celler O / N vid 30 ° C i ett lämpligt selektivt SD-medium för plasmid underhåll tills en stationär fas uppnås. Odla celler i provrör eller i en 96-brunnsplatta, beroende på antalet prover som skall analyseras (avsnitt 2).
2. Cell Förberedelse för analys
- När ett litet antal prover (N≤15) är, som skall analyseras, späda cellerna och ersätter mediet enligt följande:
- Späd 50 | il av celler från ett O / N-kulturen med 150 | il av SD-medium per brunn i en 96-brunnars platta (klar botten). Observera, det första provet betecknas endast som tomt innehåller medium.
- Bestäm OD 600 värdena för proven i 96-brunnars platta med användning av en mikroplattläsare.
- Beräkna den faktiska OD 600 i varje brunn genom att multiplicera OD 600 behandlingen med utspädningsfaktorn (x4), från which värdet av den tomma läsning subtraheras. Normalisera de resulterande värdena genom att dividera med 0,55 för att erhålla en beräknad bana-längd av 1 cm enligt Lambert-Beers lag. Notera detta värde är konstant vid mätning av OD 600 av 200 | il av celler i en standard 96-brunnsplatta.
- Beräkna den exakta volymen som behövs för erhållande av jästceller vid mängd ekvivalent till OD 600 av 0,25 och överföra det till ett Eppendorf-rör.
- Centrifugera ner cellerna vid hög hastighet (12.000 x g) under 1 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 ml av den lämpliga selektiva mediet (se avsnitt 3.1) för erhållande av OD 600 av 0,25.
- Överför 200 | il av de utspädda stammarna till en ny brunn i en 96-brunnsplatta.
- När ett stort antal prover (N> 15) är, som skall testas, späd cellerna och ersätta mediet utan föregående OD 600 mätningen, enligt följande:
- Överför 10 ìl av stationära cellervuxen O / N i en 96-brunnars platta i en ny 96-brunnsplatta innehållande 190 | il (utspädning 1:20) av de lämpliga selektiva medier (se avsnitt 3.1).
3. Tillväxt Kinetics i Liquid Culture under selektiva betingelser (Gils)
- Använd följande media för tillväxt mätningar med Ura3-degron reporter:
- För positiva kontroller av jästtillväxt under icke-restriktiva villkor, användning plasmid selektiva SD-media (se avsnitt 1.2). Om ingen plasmid val, till exempel när man använder en integrerande plasmid som Deg1 -UV, SD-medium som innehåller alla nödvändiga aminosyror (SD komplett) kan användas.
- För experimentprover som mäter tillväxten under restriktiva förhållanden, använd SD-URA-medium.
- Ställ en multimod-mikroplattläsare att. En inkubationstemperatur av 30 ° C, OD 600 mätintervall av 15 min och en orbital och linjära skakning cykler av 1 min varje sju min <br /> OBS: Denna dual-mode skakningen var optimerad för att erhålla homogen fördelning av celler; dock kan andra skakar lägen eller ens någon skakning fungera lika bra.
- Inkubera cellerna vid 30 ° C i en mikroplattläsare O / N eller tills cellerna har nått den stationära fasen (12-24 h).
- Exportera rådata till ett kalkylblad.
- Bestäm jäst tillväxt kinetik använder MDTcalc, ett anpassat program som beräknar minimal tid (i timmar) för cellerna att fördubbla sin befolkningsstorlek (Minimal Fördubbling Time (MDT), för detaljer se avsnitt 4).
4. Beräkning av Minimal Fördubbling Time (MDT): Principer för MDTcalc Algorithm
OBS: Principer för MDTcalc algoritmen, med hjälp av ett representativt urval av Try467 jästceller (tabell 2) odlas i SD komplett media, illustreras i tabell 1 och figur 1, som visar en kalkylbladsdata och tillväxt tomter, restivt.
- Subtrahera OD 600 tomma värden, som erhållits i respektive brunn, från var och en av de gjorda avläsningarna i provkällan. Dela upp de resulterande skillnaderna med 0,55 (för 96-brunnar) för att korrigera för jusväglängd. Plotta de slutliga värdena (Tabell 1, Träns.) Mot tiden för att producera den färdiga jästtillväxtkurvan (OD 600 / h) (Figur 1A).
- Beräkna log 2 (OD 600) för var och en av de transformerade värdena för att omvandla den logaritmiska tillväxtfasen till en linjär kurva (Figur 1B).
- Beräkna lutningen på en 10 tidpunkter intervall (N = 10) med början vid tiden 0 och flytta en tidspunkt i taget tills N <10 (tabell 1, Lutning, Figur 1C).
- Beräkna det inverterade värdet av varje lutning för att erhålla den tid som krävs för cellpopulationen att dubblera (tabell 1, 1 / Slope, Figur 1C). Beräkna den minimala1 / lutningsvärde för att bestämma den MDT (tabell 1, svart rektangel; Figur 1C). Extrahera den beräknade MDT för celler i provet (Tabell 1, 1 / Slope, svart rektangel) från det valda tidsintervallet (tabell 1, beskrivs av röd rektangel, figurerna 1B, 1D).
OBS: Hastigheten för celltillväxt på SD-URA-medium är omvänt proportionell mot den MDT.
5. Använda MDTcalc
- Kopiera de kompletterade programfiler till en angiven mapp i datorn.
- Se till kalkylblad som innehåller tillväxtdata sparas och stängs. Öppna MDTcalc tillämpningsprogrammet för att se startskärmen visas.
- Sätt den information som krävs, vilket framgår i figur 2:
- Under "Sökväg", klicka på rektangeln till höger för att hitta kalkylbladsfilen.
- Under "Sheet namn", skriver tabellnamn där than rådata är belägen.
- Under "Startposition", sätt i kalkylbladet koordinaten för tiden 0 i det första provet.
- Under "Tid kolumnen" sätter bokstaven definierar platsen för tidpunkten kolumnen (tid bör ges i sekunder).
- Under "Blank kolumnen" sätter bokstaven definierar platsen för tom kolumn (vanligtvis, men inte nödvändigtvis i brunn A1 i 96-brunnar).
- Under "OD", välj den minimala transforme OD 600 värde som krävs för att inleda MDT beräkning (vanligen 0,15-0,25). Om värdet förhindrar beräkningar av MDT för kulturer i lag-fas på grund av överdriven utspädning så att MDT beräknas endast för prover som når den definierade OD 600 värde eller högre.
- När det sista värdet har angivits, tryck på 'calculate "knappen längst ned på skärmen. Se till att förloppsindikatorn till höger gradvis ändras till gReen. Öppna inte kalkylbladsfilen under beräkningsprocessen.
- Exportera två uppsättningar data som visas automatiskt på skärmen vid slutförandet av beräkningen MDT till ett kalkylblad. Säkerställa att data inkluderar: (a) MDT värde för varje brunn som passerar den minimala OD-värde test (såsom anges i avsnitt 5.2.1.6) och (b) den initiala tidspunkten av intervallet från vilken MDT beräknades (Start tid).
- Sätt den information som krävs, vilket framgår i figur 2:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Undersöker rollen av enzymer av Doa10 vägen i nedbrytningen av ett reportersubstrat
För att testa giltigheten av Gils metoden det var jämfört med en traditionell analys nedbrytning. Detta experiment bedömer den relativa betydelsen av komponenter i ER-membranet lokaliserad Doa10 E3-ligas komplex 20,21 till nedbrytningen av proteinet kvalitetskontroll reporter substrat Deg1- VU (Figur 3A). Den Deg1- VU plasmiden integreras i vildtyp-celler eller i celler som saknar genen för E2-konjugerande enzym, UBC7 (ubc7) och proteinstabilitet bestämdes därefter genom en CHX chase-analysen 6. Anti-FLAG-immunblotting avslöjade en stabil Deg1 -VU proteinband i ubc7 celler som var frånvarande i vildtyp-celler (figur 3B). Frånvaron av Deg1 -VU i vildtypceller är hänförligtted till dess kontinuerliga nedbrytning som avskaffades ubc7 celler, vilket indikerar att Deg1 -VU stabilitet är starkt beroende av Ubc7.
Självklart är den nedbrytning av Deg1- VU snabb. Däremot kan den relativa nedbrytningshastigheten inte bestämmas av en CHX analys eftersom proteinet är omöjligt att spåra i vildtypsceller från början. Följaktligen har det nyligen utvecklade GILS analysmetod användes, i syfte att jämföra de relativa skillnaderna i kinetiken för proteinnedbrytning mellan vildtyp och olika mutanta stammar (fig 3C). Inledningsvis var vild typ, ubc6, ubc7 eller doa10 celler som uttrycker Deg1 -VU odlas på SD komplett medium. För att mäta Gils tvättades cellerna och inkuberades i SD-URA. MDT beräkning avrättades som exemplifieras i protokollet. Figurerna 3C, 3D visar liknande tillväxtkurvor och beräknad MDT (~ 2,5 timmar) för alla stammar som odlas i SD komplett, excluding möjligheten att strykningen av någon av de undersökta generna påverkar celltillväxt. Däremot inkubation i SD-URA lett till dålig tillväxt vildtypceller (MDT = 6,34), medan endast en mindre tillväxt defekt observerades i de muterade stammar (MDT ~ 3 tim).
Undersöker effekten av olika mutanter av E2 konjugera enzymet Ubc7 på nedbrytningen av Deg1- VU
Det faktum att Ubc7 är absolut krävs för nedbrytning Deg1- VU möjliggör noggrann bedömning av även partiella effekter av olika mutanter E2, eftersom den experimentella spektrum av systemet är mycket bred. Följaktligen var plasmider innehållande vildtyp eller mutant UBC7 integreras Ubc7 celler uttryck Deg1 -VU och deras bidrag till nedbrytningen bestämdes genom Gils. Som väntat var snabba tillväxt kinetik observerades i celler som uttrycker Ubc7 med aktivt-site munare C89S och N81A 22 (Figur 4). Dessutom två mutanter förutspådde att indirekt hindra Deg1 -VU nedbrytning (V25G och H94K) testades. Dessa mutationer förbättrade också celltillväxt, jämfört med vildtyp Ubc7, om än i mindre grad än mutanterna aktiva-site (genomsnitt MDTS på 3,4 tim för V25G och H94K jämfört med genomsnitts MDTS av 2,7 timmar för C89S och N81K) (Figur 4 ). Sålunda kan GILS metoden användas för noggrann mätning av det relativa bidraget av olika nedbrytningsfaktorer för stabiliteten i en reportersubstrat.
Isolering och utvärdering av nya degrons
Den Gils-systemet användes även i en hög genomströmning skärmformat för att identifiera nya degrons och kvantifiera deras relativa potens, dvs graden av vilka de inducerar nedbrytning (Figur 5). För att optimera identifieringen av bona fide degrons, ytterligareselektionssteg, som är tillväxt i närvaro av fluoroorotinsyra (5-FOA), tillsattes. Ura3 omvandlar effektivt 5-FOA till en giftig förening (5-FU), som kan fungera som en positiv selektering för isolering av jäststammar där Ura3 destabiliseras 16,23. Att identifiera nya degrons ades ett bibliotek av reporterplasmider genereras genom sammansmältning av slumpmässiga fragment härledda från en jäst-cDNA-bibliotek till Ura3-GFP plasmid 24 (figur 5A). GFP-delen lades till för att möjliggöra en sekundär skärm och ge information om lokalisering av fusions degron (se diskussion). Biblioteket transformerades till jäst, selekteras sedan i närvaro av 5-FOA (figur 5B) och positiva kloner isolerades och åter ympades på agarplattor i en 96-brunnars plattformat. Varje koloni överfördes till 96-brunnar, odlades O / N och utspädd i en ny 96-brunnar som beskrivs i avsnitt 2.2. Det förväntas att tillväxten av celler i SD-URA-mediumkommer att korrelera med graden av Ura3 uttryck, vilket är resultatet av degron potens att inducera nedbrytning. Detta bekräftades senare genom att tillämpa Gils (figur 5C). Vi bekräftade att alla slumpmässigt plockade kolonier som var utvalda på förhand med 5-FOA visade liknande MDT-värden, på SD-LEU medium (figur 5C, tomma staplar). Däremot alla kloner visade rörliga tillväxttakt på SD-URA, som var betydligt långsammare än celler som uttrycker kontroll Ura3-GFP (data visas ej). Som nämnts finns det ett omvänt förhållande mellan tillväxt på SD-URA och MDT. Sålunda gäller att ju högre MDT, är mer potent den degron. Faktiskt alla MDTS härrör från positivt selekterade kloner var högre än för kontroll (ovanför den röda linjen) (Figur 5C, fyllda staplar).
<strong> Tabell 1. Illustration av beräkningen av jäst MDT. Tids enheter är timmar (h). Blank och prov är från OD 600 läsningar. Transformation (Trans.) är det OD 600 värde efter tomt subtraktion och korrigering stig-längd. Log 2 beräknas från transformerade data. Slope är Log 2 (OD 600) värden inom följd av intervaller på 10 tidpunkter dividerat med tiden. 1 / Lutning är den tid som krävs för cellpopulationen att duplicera sig själv. Svart rektangel markerar MDT värde. Röd rektangel markerar tidsintervallet från vilken MDT beräknades.
| Jäst | Genotyp | Källa |
| TRy467 | α, his3Δ1, lys2Δ0, ura3Δ0, leu2Δ; 0 | Euroscarf |
| TRy508 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2 | Denna studie |
| TRy528 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [N81A] -3HA :: HANS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Denna studie |
| TRy530 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [C89S] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Denna studie |
| TRy532 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [H94K] -3HA :: HANS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Denna studie |
| TRy556 | α, his3-Δ200 :: pRS303 :: HANS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7Δ :: LEU2 | Denna studie |
| TRy563 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2, ubc6Δ :: kanMX | Denna studie |
| TRy633 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [V25A] -3HA :: HANS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Denna studie |
| TRy786 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 :: LEU, doa10Δ :: HIS3 | Denna studie |
Tabell 2. Förteckning av jäststammar som användes i denna studie.
| Plasmider som användes i denna studie | ||
| Plasmid | Relevanta markörer | Källa |
| pTR717 | YDpK-MET25p-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 (integrativ plasmid innehållande LYS1) | Denna studie |
| pTR1412 | pRS315-CUP1p-URA3-HA-GFP (LEU) | Denna studie |
| Ytterligare lämpliga reporterplasmider | ||
| Plasmid | Relevanta markörer | Källa |
| pOC9-CL1 | pOC9-CUP1p-HA-URA3 (TRP1) | (17) |
| URA3-2 (GFP) | pPS414-TRP1p-MYC-ura3-2-GFP | Lewis och Pelham |
Referens Tabell 3. Förteckning över plasmider som används i denna studie. Lewis, MJ & Pelham, HR Ineffektiv kvalitetskontroll av värmekänsliga proteiner på plasmamembranet PLoS One 4, e5038, doi:. 10,1371 / journal.pone.0005038 (2009).
Figur 1. Principerna för beräkning av MDT. Try467 jästceller vid OD 600 0,22, inkuberades i SD-fullständigt medium under den angivna tidsperioden. OD 600 mätningar gjordes varje ~ 15 min och data samlades in i ett kalkylblad. (A) Transforme OD 600-värdena i tabell 1 som funktion av tiden. (B)Log 2 av OD 600 plottad mot tiden Röd linje.: Anger tidsintervallet från vilken MDT beräknades (D). (C) Jäst tillväxthastighet (lutning) beräknades genom att mäta förändringar i OD 600 på varandra följande 10 tidpunkter (förutsatt linjäritet) över tid Starttid:. Den tidpunkt från vilken beräkning inleddes. (D) Den tid som krävs för jäst att fördubbla är inversen av lutningen från (C) (1 / Slope) MDT:. Den beräknade Kortaste dubbleringstid (i h).
Figur 2. MDTcalc startskärmen: Protokoll avsnitt 5.1. Typiska ingångsvärden som förs in visas.
Figur 4. Mätning relativa nedbrytningshastigheter Deg1 -VU i mutantstammar Ubc7 Vänster:. Rita av de transformerade OD 600 värden som uppmätts under replikering av w ILD-typ, ubc7 Δ och de angivna Ubc7 mutanterna, som funktion av tiden. Celler som uttrycker Deg1 -VU odlades på SD-URA-medium och OD 600 mättes varje ~ 15 min. Höger: MDT för varje stam har beräknats med hjälp MDTcalc.
1 / 52021fig5highres.jpg "width =" 500px "/>
Figur 5. En högeffektiv analys för identifiering och isolering av nya degrons. (A) Schematisk presentation av funktionerna i URA3-GFP-cDNA-reporter. (B) Ett flödesschema som beskriver de experimentella stegen för isolering av jäststammar som bär en degron. Plasmiden biblioteket beskrivet i A omvandlades till Try467 celler, följt av selektion på SD-leu-plattor. Kolonier replikeras till SD-Leu-plattor innehållande 5-FOA och snabbväxande kolonier samlas in och samman på plattor i en ordnad array. (C) Kolonier uttrycker Ura3-GFP-cDNA som växte på plattor innehållande 5-FOA inkuberades i antingen SD-LEU eller SD-URA medier för 20 timmar. OD 600 mättes varje ~ 15 min och den minimala jäst fördubbling tid (MDT) beräknades med hjälp av MDTcalc programvara Nr degron:. En plasmid som uttrycker Ura3-GFP utan degron, fungerar som en positiv kontroll för gr'owth' röd linje:. tröskelvärde bestäms av MDT värdet av kontrollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en analys baserad på celltillväxt för bestämning av relativa protein nedbrytningshastigheter, benämnda "Tillväxt kinetik i flytande odling under selektiva betingelser '(GILS). Den Gils-analysen har flera fördelar: Det är enkelt att sätta upp, datainsamling och analys är enkel och det är extremt modulärt. Följaktligen kan GILS anbringas samtidigt på flera prov på ett användarvänligt flerbrunnsplattformat som kan anpassas till automatisering för hög genomströmning applikationer. Det viktigaste är att Gils mycket reproducerbara, kvantitativa och robusta data och är mer flexibelt än agar-platta baserad tillväxtanalyser som väljer för positiv / negativ tillväxt. Dessutom är Gils mycket känslig eftersom den kan upptäcka små variationer i proteinnedbrytningshastigheter eller steady-state-nivåer, vilket speglar aktiviteten hos relevanta UPS komponenter eller degrons. Slutligen Gils analyser kräver betydligt kortare tillväxtperioder (<12 timmar) jämfört med growth analyser på agarplattor (vanligtvis 2-4 dagar).
Medan GILS analys är mycket användbar för att studera proteinnedbrytning bör flera viktiga överväganden beaktas. Till exempel är det viktigt att använda en isogen jäststam bakgrunden på grund av stamspecifika tillväxtegenskaper. Vidare att fastställa analys giltighet, varje försök bör upprepas minst tre gånger under identiska förhållanden, viktigast av allt, den initiala celltätheten (OD 600), tillväxttemperatur och cellodling skakande intensitet bör inte ändras. Det rekommenderas därför att det specifika analysprotokoll lagras i mikroplattläsare programvara för upprepad användning. Ytterligare en variabel som bör övervägas är där degron är placerad i Ura3. Eftersom degron ställning kan bestämma dess funktion, positionering vid antingen C eller N 'regioner måste empiriskt testas.
Kalibrering av reporter protEin uttrycksnivå är också avgörande för framgångsrik tillämpning av Gils. En optimal reporter är en som effektivt bryts ned av systemet under utredning och därför ger uracil auxotrofi. Dock bör variationer i auxotrofi också troget spegla reportern stabiliteten. Detta kan bestämmas empiriskt genom föregående provning av korrelationen mellan reporterproteinnedbrytningshastigheter, som bestäms av ytterligare biokemiska metoder och MDT-värden, som bestäms av Gils (figur 3B). Ett vanligt problem som uppstår när det basala steady state expression av en reporter inte når en tröskelnivå och är sålunda alltför lågt för att möjliggöra tillväxt på SD-URA även när den är helt stabiliserad. Ett sådant problem kan övervinnas genom att placera reporter expression under kontroll av en inducerbar promotor som ökar basalproteinexpression utan att påverka nedbrytning. Promotoraktivitet i sådana system bör finkalibrerade att undvika permanent tillväxt på SD-URA beror på high proteinnivåer och reporterenzymaktivitet även när det är delvis försämrad. Initiativtagarna och uttrycks förhållanden som beskrivs i denna studie valdes eftersom de tillåter känsliga regleringen av proteinuttryck: MET25p och CUP1 p är metabolit-inducerade promotorer vilkas verksamheter kan finstämt genom kontroll av metionin och koppar (tabell 3).
Kvalitetskontroll reporter substrat (som de som beskrivs i denna studie) kan bilda intracellulära aggregat som kan sekvestrerar Ura3 och förhindra dess funktion. I ett sådant fall uracil auxotrofi kan felaktigt tolkas som ett resultat av proteinnedbrytning. För att testa tendensen olika degrons att aggregera, bör ytterligare en reporter användas. Till exempel URA3-GFP reporter utformad för degron skärm (figur 5A), vilket gör visualisering av intracellulära aggregat genom fluorescensmikroskopi av celler som växer i preseiou av 5-FOA. Dessa aggregat visas som tät GFP foci som klart skiljer sig från diffusa utseende lösligt protein (data visas ej). URA3-GFP-degron reporter kan på liknande sätt användas för att bestämma effekten av den degron på protein samlokalisering och subcellulär distribution. Den kan också användas för att följa nedbrytningen av valda substrat med flödescytometri, som en sekundär skärm 25.
En mest signifikant fördel med GILS metoden är att den är tillräckligt flexibel och kan sålunda lätt anpassas till en mängd olika tillämpningar utöver de som beskrivs i detta dokument. Till exempel kan förfarandet även användas för att undersöka lämpligheten av proteasomen under olika förhållanden. I detta fall är en icke-ubiquitylated proteasom substrat såsom ornitindekarboxylas (ODC) är sammansmält med Ura3. Metoden kan också testa proteinnedbrytning i distinkta intracellulära fack när en specifik lokaliseringssignal användes.I denna studie Vma12 förankrad reportern till ER-membranet (fig 3, 4). På samma sätt kan en nukleär lokaliseringssignal (NLS), ER retentionssignalen (KDEL) eller cytosolen (avsaknad av en specifik signal) användas. Ett system som möjliggör samtidig analys av proteinnedbrytning i olika intracellulära fack kan ha stor inverkan på vår förståelse för hur proteinnedbrytnings nätverk fungerar. Slutligen kan principerna för den urvalsmetod användas för att forskning av proteinnedbrytning i andra modell cellbaserade system, från bakterier till humana celler, vilka alla kräver URA3-genprodukten för överlevnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma - Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma - Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma - Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma - Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96-well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma - Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used. | |
| MDTcalc | Experimental software |
References
- Hershko, A., Ciechanover, A.
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
- Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
- Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
- Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
- Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
- Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
- Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
- Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. Genetics. 117, 5-12 (1987).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
- Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
- Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, Academic Press. (1991).
- Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
- Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
- Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
- Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
- Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).
