Abstract
Proteina degradazione da parte del sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) è un importante meccanismo di regolazione per le proteine omeostasi in tutti gli eucarioti. L'approccio standard per la determinazione intracellulare degradazione delle proteine si basa su test biochimici per seguire la cinetica di declino proteine. Tali metodi sono spesso laboriosa e che richiede tempo e quindi non suscettibili di esperimenti volti a valutare diversi supporti e condizioni di degrado. In alternativa, sono stati sviluppati saggi di crescita a base di cellule, che sono, nel loro formato convenzionale, saggi end-point che non può determinare quantitativamente relativi cambiamenti nei livelli di proteina.
Qui si descrive un metodo che determina fedelmente le variazioni dei tassi di degradazione delle proteine da loro accoppiamento con lievito cinetica di crescita delle cellule. Il metodo si basa su un sistema di selezione stabilito dove uracile Auxotrofia di URA3 -deleted cellule di lievito viene salvato da una proteina reporter esogena espressa, Composto da una fusione tra il gene URA3 essenziale e determinante degradazione (degron). La proteina reporter è progettato in modo che la sua velocità di sintesi è costante mentre la sua velocità di degradazione è determinata dal degron. Come la crescita delle cellule in terreno uracile-carente è proporzionale ai relativi livelli di URA3, cinetica di crescita sono del tutto dipendenti dalla degradazione delle proteine giornalista.
Questo metodo di misura con precisione variazioni di intracellulari cinetica di degradazione delle proteine. E 'stato applicato a: (a) valutare il contributo relativo dei fattori-ubiquitina coniugare note alla proteolisi (b) E2 coniugare enzima struttura-funzione analizza (c) Identificazione e caratterizzazione di nuovi degrons. L'applicazione del sistema basato URA3 degron- trascende campo degradazione delle proteine, come può anche essere adattato ai cambiamenti di monitoraggio dei livelli di proteine associate con funzioni di altre vie cellulari.
Introduction
Il sistema di degradazione ubiquitina-proteasoma è una grande macchina di regolamentazione, che è stata implicata nel mantenimento dell'omeostasi delle proteine in tutti gli eucarioti. Il gruppo di continuità coniuga inizialmente più molecole di ubiquitina ad una proteina bersaglio dopo che la proteina poli-ubiquitina-tag è degradata dal proteasoma 26S. Nella maggior parte dei casi, il fattore limitante per l'ubiquitina mediata degradazione è ubiquitinazione substrato, mediato da E2 coniugando enzimi e E3 legatura enzimi (E3 ligasi) 1. Di conseguenza, la stabilità intracellulare di specifiche proteine riflette la loro suscettibilità alla ubiquitina-coniugazione e l'attività dei loro enzimi ubiquitinazione affini.
Ligasi E3 sono i componenti di riconoscimento del substrato principali del gruppo di continuità. Come tali, questi enzimi riconoscono degrons nei loro substrati che sono o assenti o non esposto nelle loro controparti stabili 2. Per esempio, molti regolatori del ciclo cellulare must essere sintetizzato e degradato in maniera temporalmente specifico al fine di mantenere la progressione del ciclo cellulare in ordine. La degradazione di queste proteine è spesso controllata dalla fosforilazione, mediata da cellule di segnalazione chinasi regolate 3,4. D'altra parte, le proteine aberrante piegati sono riconosciuti attraverso degrons criptici. Si tratta di regioni che normalmente sono nascosti nella struttura nativa e sono esposti su struttura perturbazione. Tali degrons comprendono domini idrofobici 5-7 e segmenti intrinsecamente disordinati 8.
Dalla scoperta fondamentale della ubiquitina-sistema di degradazione delle proteine e la caratterizzazione dei suoi fondamentali nei lisati di reticolociti 9, genetica del lievito è stato determinante nella scoperta molti dei componenti del sistema ubiquitina 10. Il successo di lievito come organismo modello per l'analisi sistematica della degradazione proteica dal gruppo di continuità è dovuto principalmente al fatto che il gruppo di continuità è altoly conservato in tutti gli eucarioti 4, unita alla loro riconducibilità come sistema sperimentale. In effetti, i sistemi a base di lievito sono comunemente impiegati per decifrare i meccanismi di azione della macchina ubiquitinazione.
Studiando proteina degradazione mediante biochimici solito richiede la preparazione di estratti cellulari. Mentre le proteine cellulari animali possono essere estratti in condizioni relativamente blande che conservano le interazioni e la funzione della proteina, la presenza di una parete cellulare robusto in lievito 11 richiede condizioni perturbazione considerevolmente più dure che possono influenzare il recupero delle proteine. In effetti, diverse modalità di rottura delle cellule di lievito variano notevolmente nella loro capacità di recuperare proteine intatte in quantità che rappresentano correttamente la loro abbondanza relativa cellulare. Ulteriore inesattezza è inerente i diversi metodi utilizzati per la determinazione del tasso di degradazione di proteine specifiche: a base di etichettatura relativa ad esperimenti metabolici "pulse-chase" seguita da immunoprecipitation, per isolare proteine specifiche 12, spesso non è strettamente quantitativo. Così, quando la degradazione delle proteine viene confrontato con questo metodo, estrema cautela deve essere esercitata nell'interpretazione dei risultati. Per ovviare a questo inconveniente, un cicloesimmide alternativa (CHX) test inseguimento può essere impiegato 12. In questo saggio, l'inibitore di traduzione è aggiunta a colture cellulari e cambiamenti temporali nei livelli di proteine allo steady-state vengono successivamente monitorati. Tuttavia, l'utilizzo di CHX è limitato alle proteine con emivite relativamente brevi (<90 min), l'inibizione a lungo termine della sintesi proteica è citotossico. In particolare, entrambi i saggi suddette richiedono l'uso di anticorpi specifici per proteine che non sono sempre disponibili.
Per superare queste limitazioni tecniche, i ricercatori hanno sviluppato diversi approcci che non richiedono l'estrazione delle cellule e la manipolazione diretta di proteine. Un approccio si basa sulla creazione di yea auxotrophicceppi st, ottenuti per delezione di geni codificanti enzimi metabolici essenziali. Tali geni includono HIS3, LEU2, LYS2 e TRP1, codifica per gli enzimi necessari per la biosintesi degli aminoacidi, così come URA3 che codifica OMP decarbossilasi (URA3), un enzima essenziale della pirimidina ribonucleotide biosintesi. URA3 è stato ampiamente utilizzato in studi di degradazione proteica. In questi test, espressione costitutiva di URA3 salva la crescita delle cellule URA3 in uracile con deficit medio 13. Di conseguenza, destabilizzare URA3 attraverso la fusione di un degron può ridurre la crescita delle cellule su terreno minimo privo di uracile. Questo metodo è stato utilizzato in diversi studi di degradazione delle proteine, compresa l'individuazione di degrado determinanti 5, E3 ligasi 14 e ubiquitinazione ausiliario fattori 15 e la scoperta di nuovi UPS degrons 16. Tutti questi metodi impiegati crescita cellulare su piastre di agar come test di lettura. Tuttavia, tche il criterio di crescita (crescita positivo / negativo), mentre la robusta ed efficiente, è per lo più qualitativa e non fornisce informazioni quantitative che è importante per valutare la potenza di un degron o il contributo relativo dei diversi fattori di degrado ausiliari.
Abbiamo quindi messo a punto e utilizzato vettori di lievito e metodi di screening che consente un'analisi sistematica e quantitativa di degradazione delle proteine da parte del URA3 -degron sistema di fusione. Il protocollo si basa su un saggio di facile impugnatura che misura la cinetica di crescita in coltura liquida in condizioni selettive (Gils) e sulla generazione delle curve di crescita standard. Cinetica di crescita del lievito sono caratterizzate da tre fasi principali - il ritardo, l'esponenziale (log) e la fase stazionaria. Calcolo della cinetica di replicazione del lievito durante la fase log in condizioni selettive, che è determinata dai livelli di espressione della URA3-degron, fornisce un imparziale misurazione quantitativa of degradazione delle proteine. Questo metodo può essere applicato a misurare e comparare i tassi di degradazione di substrati multipli UPS contemporaneamente in più ceppi e in diverse condizioni.
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Protocol
Cultura 1. Cella
- Trasformare le opportune cellule di lievito auxotrofi, come Try467 (Tabella 2), con un plasmide contenente (a) un URA3 -degron fusione e (b) un indicatore metabolico aggiuntivo per la selezione plasmid e manutenzione.
NOTA: Un esempio di un plasmide adatto è YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-URA3 (LYS2) (Deg1- UV) Questo è un plasmide integrativo di lievito contenente una proteina di fusione comprendente Deg1 - un degron derivato dalla trascrizione di lievito. fattore Mat2 17, FLAG epitopo - per il rilevamento mediante immunoblotting, Vma12 - una proteina stabile ER, e URA3 15,18 (Figura 3A). (Per plasmidi utilizzati in questo studio e per ulteriori esempi di plasmidi adatti Vedere la Tabella 3). - Per la selezione plasmide e la manutenzione, mantenere le cellule in piastre di agar in un sintetico adatto Defined (SD) medium privo di marcatori di selezione amino acidi
- Grow cellule O / N a 30 ° C in un mezzo selettivo SD adatto per la manutenzione plasmide fino al raggiungimento di una fase stazionaria. Far crescere le cellule in provette o in una piastra a 96 pozzetti, a seconda del numero di campioni da esaminare (sezione 2).
2. Preparazione delle cellule per l'analisi
- Quando un piccolo numero di campioni (N≤15) sono da dosare, diluire le cellule e sostituire il mezzo come segue:
- Diluire 50 ml di cellule da un / cultura N O con 150 ml di SD media per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti (fondo chiaro). Nota, il primo campione è designato come vuota contiene solo medio.
- Determinare i valori di OD 600 dei campioni nella piastra a 96 pozzetti utilizzando un lettore di micropiastre.
- Calcolare il diametro effettivo 600 in ciascun pozzetto moltiplicando il valore OD 600 per il fattore di diluizione (x4), da which il valore della lettura vuota viene sottratto. Normalizzare i valori ottenuti dividendo per 0,55 per ottenere un percorso di lunghezza calcolata di 1 cm secondo la legge di Lambert-Beer. Nota, questo valore è costante durante la misurazione del diametro esterno 600 di 200 microlitri di cellule in una piastra da 96 pozzetti standard.
- Il volume esatto necessario per ottenere cellule di lievito in quantità equivalente ad OD 600 di 0,25 e trasferirlo in una provetta Eppendorf.
- Centrifugare le cellule ad alta velocità (12.000 xg) per 1 min.
- Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno selettivo appropriato (vedere paragrafo 3.1) per ottenere OD 600 di 0,25.
- Trasferire 200 ml di ceppi diluiti in un pozzetto in una piastra a 96 pozzetti.
- Quando un gran numero di campioni (N> 15) sono da esaminare, diluire le cellule e sostituire il mezzo senza preventiva OD 600 di misura, come segue:
- Trasferire 10 ml di cellule stazionarieadulto O / N in una piastra a 96 pozzetti in una nuova piastra a 96 pozzetti contenenti 190 ml (diluizione 1:20) dei terreni selettivi appropriati (vedere paragrafo 3.1).
3. Cinetica di crescita in coltura liquida In condizioni selettive (Gils)
- Utilizzare i seguenti supporti per le misure di crescita con il giornalista URA3-degron:
- Per i controlli positivi di crescita del lievito in condizioni non restrittive, uso plasmide supporto SD selettivi (vedere paragrafo 1.2). Se non è richiesta la selezione plasmide, per esempio, quando si utilizza un plasmide integrativo come Deg1 -UV, medio SD contenente tutti gli aminoacidi necessari (SD completo) può essere utilizzato.
- Per i campioni sperimentali di misura della crescita in condizioni restrittive, utilizzare SD-URA medio.
- Impostare un lettore di micropiastre multimodale a:. Una temperatura di incubazione di 30 ° C, OD 600 intervalli di misurazione di 15 minuti, e un cicli orbitali e lineari agitando di 1 min ogni sette min <br /> NOTA: Questo dual-mode agitazione è stato ottimizzato per ottenere una distribuzione omogenea delle cellule; tuttavia, altri modi di agitazione o addirittura nessun scuotimento può funzionare così.
- Incubare le cellule a 30 ° C in un lettore di micropiastre O / N o finché le cellule hanno raggiunto la fase stazionaria (12-24 ore).
- Esportare i dati grezzi in un file di foglio di calcolo.
- Determinare la cinetica di crescita del lievito utilizzando MDTcalc, un software personalizzato che calcola il tempo minimo (in ore) per le cellule di raddoppiare il loro numero di abitanti (minimo tempo di raddoppio (MDT), per dettagli vedere paragrafo 4).
4. Calcolo del minimo tempo di raddoppiamento (MDT): Principi dell'algoritmo MDTcalc
NOTA: Principi dell'algoritmo MDTcalc, utilizzando un campione rappresentativo di cellule di lievito Try467 (Tabella 2) derivate in SD multimediale completa, sono illustrati nella Tabella 1 e Figura 1, che mostra un foglio di calcolo di dati e di crescita trame, respecmente.
- Sottrarre OD 600 valori vuoti, ottenuti nella rispettiva bene, da ciascuno dei valori ottenuti nel pozzetto. Dividere le differenze risultanti da 0,55 (per piastre a 96 pozzetti) per correggere la lunghezza del percorso ottico. Tracciare i valori finali (Tabella 1, Trans.) Contro il tempo per produrre la curva di crescita del lievito effettiva (OD 600 / h) (Figura 1A).
- Calcolare log 2 (OD 600) per ciascuno dei valori trasformati per convertire la fase di crescita logaritmica in una curva lineare (Figura 1B).
- Calcolare la pendenza di un intervallo di 10 punti temporali (N = 10) a partire dal tempo 0 e spostando contemporaneamente punto alla volta fino a N <10 (Tabella 1, Slope; Figura 1C).
- Calcolare il valore inverso di ciascuna pista per ottenere il tempo richiesto per la popolazione cellulare di raddoppiare (Tabella 1, 1 / pendenza; Figura 1C). Calcolare il minimo1 / valore di pendenza per determinare la MDT (Tabella 1, rettangolo nero; Figura 1C). Estrarre il MDT calcolato per le cellule nel campione (Tabella 1, 1 / Slope, rettangolo nero) dal l'intervallo di tempo selezionato (tabella 1, delineato dal rettangolo rosso, figure 1B, 1D).
NOTA: Il tasso di crescita delle cellule su SD-URA media è inversamente proporzionale alla MDT.
5. Uso MDTcalc
- Copiare i file di programma integrati in una determinata cartella sul computer.
- Assicurarsi che il file di foglio di calcolo contenente i dati di crescita viene salvato e chiuso. Aprire il programma applicativo MDTcalc per vedere l'inizio viene visualizzata la schermata.
- Inserire le informazioni richieste, come mostrato nella Figura 2:
- Sotto 'Percorso file', cliccare sul rettangolo a destra per individuare il file di foglio di calcolo.
- Sotto 'nome foglio', scrivere il nome del foglio elettronico dove tegli dati grezzi si trova.
- Sotto 'Posizione di partenza', inserire la coordinata foglio di calcolo del tempo 0 del primo campione.
- Sotto 'Tempo colonna', inserire la lettera che definisce la posizione della colonna punto di tempo (tempo dovrebbe essere fornito in secondi).
- Sotto 'colonna vuota', inserire la lettera che definisce la posizione della colonna vuota (solitamente, ma non necessariamente in A1 della piastra a 96 pozzetti).
- Sotto 'valore OD', scegliere la trasformata OD 600 valore minimo richiesto per l'avvio di calcolo MDT (di solito ,15-0,25). L'impostazione di questo valore previene i calcoli di MDT per le colture in fase di latenza a causa di eccessiva diluizione in modo da MDT viene calcolato solo per i campioni che raggiungono il valore definito OD 600 o superiore.
- Una volta inserito l'ultimo valore, premere il pulsante 'Calcola' nella parte inferiore dello schermo. Assicurarsi che la barra di avanzamento sulla destra cambia gradualmente green. Non aprire il file di foglio di calcolo durante il processo di calcolo.
- Esporta le due serie di dati che appaiono automaticamente sullo schermo al completamento del calcolo MDT in un foglio. Assicurarsi che i dati includono: (a) il valore MDT per ogni bene che supera il test minimo valore OD (come indicato nella sezione 5.2.1.6) e (b) il punto di tempo iniziale dell'intervallo da cui la MDT è stato calcolato (Inizio tempo).
- Inserire le informazioni richieste, come mostrato nella Figura 2:
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Representative Results
Indagare il ruolo degli enzimi della via Doa10 nella degradazione di un substrato giornalista
Per verificare la validità del metodo Gils è stato confrontato con un saggio degrado tradizionale. Questo esperimento valuta il contributo relativo di componenti della membrana ER-localizzato Doa10 E3-ligasi complessa 20,21 alla degradazione del substrato giornalista controllo di qualità delle proteine Deg1- VU (Figura 3A). Il plasmide Deg1- VU stato integrato in cellule wild type o in cellule privi del gene per l'enzima coniugazione E2, UBC7 (ubc7) e la stabilità della proteina è stato successivamente determinato mediante saggio CHX chase 6. Anti-Flag immunoblotting ha evidenziato una banda proteica Deg1 -Vu stabile in cellule ubc7 che era assente in cellule wild type (Figura 3B). L'assenza di Deg1 -Vu in cellule wild type è attributa al suo degrado continuo che è stato abolito in cellule ubc7, indicando che la stabilità Deg1 -Vu è fortemente dipendente Ubc7.
Ovviamente, la degradazione di Deg1- VU è rapida. Tuttavia, la relativa percentuale di degradazione non può essere determinata con un test CHX poiché la proteina è rilevabile nelle cellule wild type fin dall'inizio. Di conseguenza, il metodo di dosaggio Gils recente sviluppo è stato impiegato, per comparare le differenze relative cinetica di degradazione proteica tra wild-type e vari ceppi mutanti (Figura 3C). Inizialmente, il tipo, ubc6, ubc7 o doa10 cellule selvatici che esprimono Deg1 -Vu sono state coltivate su SD terreno completo. Per misurare Gils, le cellule sono state lavate ed incubate in SD-URA. Calcolo MDT è stato eseguito come esemplificato nel protocollo. Figure 3C, 3D mostrano curve di crescita simili e calcolato MDT (~ 2,5 ore) per tutti i ceppi coltivati in SD completa, excluding la possibilità che la soppressione di qualsiasi dei geni esaminati influenza la crescita cellulare. Al contrario, l'incubazione in SD-URA ha provocato una scarsa crescita delle cellule wild-type (MDT = 6.34), mentre solo un difetto di crescita minore è stato osservato nei ceppi mutanti (MDT ~ 3 hr).
Esaminando l'effetto di diversi mutanti della E2 coniugando enzima Ubc7 sulla degradazione di Deg1- VU
Il fatto che Ubc7 è assolutamente necessaria per Deg1- VU degrado consente una valutazione accurata degli effetti anche parziale dei vari mutanti E2, poiché il campo sperimentale del sistema è molto ampia. Di conseguenza, plasmidi contenenti wild type o mutante UBC7 sono stati integrati in cellule che esprimono Ubc7 Deg1 -Vu e il loro contributo alla degradazione è stata determinata da Gils. Come previsto, cinetica di crescita rapida sono state osservate in cellule che esprimono Ubc7 con il sito attivo muinqui- C89S e N81A 22 (figura 4). Inoltre, due mutanti prevede che ostacolare indirettamente Deg1 -Vu degrado (V25G e H94K) sono stati testati. Queste mutazioni anche migliorato la crescita delle cellule, rispetto al wild-type Ubc7, anche se in misura minore rispetto ai mutanti sito attivo (MDT media di 3,4 ore per V25G e H94K rispetto a MDT media di 2,7 ore per C89S e N81K) (Figura 4 ). Pertanto, il metodo Gils può essere utilizzato per la misurazione accurata del contributo relativo dei vari fattori di degradazione alla stabilità di un substrato giornalista.
L'isolamento e la valutazione di nuovi degrons
Il sistema Gils è stato impiegato anche in un formato a schermo un'elevata identificare nuovi degrons e quantificare la loro potenza relativa, cioè, il grado in cui inducono degradazione (Figura 5). Per ottimizzare l'identificazione di degrons in buona fede, un ulteriorefase di selezione, che è la crescita in presenza di acido Fluoroorotic (5-FOA) è stato aggiunto. URA3 converte efficientemente 5-FOA in un composto tossico (5-fluorouracile) che può servire come una selezione positiva per l'isolamento di lieviti dove URA3 è destabilizzato 16,23. Per identificare nuovi degrons, una libreria di plasmidi reporter è stato generato dalla fusione di frammenti casuali derivati da una libreria di cDNA di lievito per URA3-GFP plasmide 24 (Figura 5A). La frazione GFP è stata aggiunta al fine di consentire una schermata secondaria e fornire informazioni sulla localizzazione del degron fusione (vedi la discussione). La libreria è stato trasformato in lievito, quindi selezionato in presenza di 5-FOA (Figura 5B) e cloni positivi sono stati isolati e ri-seminati su piastre di agar in un formato di piastra da 96 pozzetti. Ogni colonia è stato trasferito in piastra a 96 pozzetti, incubati O / N, e diluito in una nuova piastra a 96 pozzetti come descritto nella sezione 2.2. Si prevede che la crescita delle cellule in SD-URA mediosarà correlata con il grado di espressione URA3, che è il risultato della potenza del degron per indurre degradazione. Questa è stata successivamente confermata mediante l'applicazione di Gils (Figura 5C). Abbiamo confermato che tutte le colonie presi a caso, che sono stati pre-selezionati con 5-FOA hanno mostrato valori simili MDT, su SD-LEU medio (Figura 5C, bar vuoti). Al contrario, tutti i cloni hanno mostrato tassi di crescita variabili su SD-URA, che erano significativamente più lento di cellule che esprimono il controllo URA3-GFP (dati non mostrati). Come indicato, vi è una relazione inversa tra tasso di crescita su SD-URA e MDT. Pertanto, maggiore è la MDT, il più potente è il degron. Infatti, tutti MDT derivati da cloni selezionati positivamente erano superiori a quella del controllo (sopra la linea rossa) (Figura 5C, barre piene).
<strong> Tabella 1. Illustrazione del calcolo delle unità di lievito MDT. Ora sono ore (h). Vuoto e del campione sono da OD 600 legge. Trasformazione (Trans.) è il valore OD 600 dopo la sottrazione vuoto e la correzione percorso di lunghezza. Log 2 è calcolata dai dati trasformati. Slope è il valore dopo consecutivo di intervalli di 10 punti di tempo diviso per il tempo log 2 (OD 600). 1 / Slope è il tempo richiesto per la popolazione di cellule di riprodursi. Nero rettangolo indica la MDT valore. rettangolo rosso indica l'intervallo di tempo da cui la MDT è stato calcolato.
| Lievito | Genotipo | Fonte |
| TRy467 | α, his3Δ1, lys2Δ0, ura3Δ0, leu2Δ; 0 | Euroscarf |
| TRy508 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: SUA, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-URA3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2 | Questo studio |
| TRy528 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [N81A] -3HA :: SUA, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-URA3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Questo studio |
| TRy530 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [C89S] -3HA :: SUA, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-URA3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Questo studio |
| TRy532 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [H94K] -3HA :: SUA, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-URA3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Questo studio |
| TRy556 | α, his3-Δ200 :: pRS303 :: SUA, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-URA3 :: LYS, trp1-1, ubc7Δ :: LEU2 | Questo studio |
| TRy563 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: SUA, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-URA3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2, ubc6Δ :: KanMX | Questo studio |
| TRy633 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [V25A] -3HA :: SUA, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-URA3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Questo studio |
| TRy786 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: SUA, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-URA3 :: LYS, trp1-1, ubc7 :: LEU, doa10Δ :: HIS3 | Questo studio |
Tabella 2. Elenco dei ceppi di lievito usati in questo studio.
| I plasmidi utilizzati in questo studio | ||
| Plasmide | Indicatori rilevanti | Fonte |
| pTR717 | YDpK-MET25p-Deg1-Flag-Vma12-URA3 (integrativo plasmide contenente LYS1) | Questo studio |
| pTR1412 | pRS315-CUP1p-URA3-HA-GFP (LEU) | Questo studio |
| Ulteriori adatti plasmidi reporter | ||
| Plasmide | Indicatori rilevanti | Fonte |
| pOC9-CL1 | pOC9-CUP1p-HA-URA3 (TRP1) | (17) |
| URA3-2 (GFP) | pPS414-TRP1p-MYC-ura3-2-GFP | Lewis e Pelham |
Tabella 3. Elenco dei plasmidi utilizzati in questo studio di riferimento:.. Lewis, MJ & Pelham, HR inefficiente controllo di qualità delle proteine termosensibili sulla membrana plasmatica PLoS One 4, e5038, doi: 10.1371 / journal.pone.0005038 (2009).
Figura 1. Principi di calcolo di MDT. Cellule di lievito Try467 a OD 600 0,22, sono state incubate in SD supporto completo per il periodo di tempo indicato. OD 600 misurazioni sono state effettuate ogni ~ 15 minuti ei dati sono stati raccolti in un foglio di calcolo. (A) trasformati OD 600 valori riportati nella tabella 1 rilevate in tempo. (B)Log 2 di diametro esterno 600 rilevate in tempo Linea rossa:. Contrassegna l'intervallo di tempo da cui la MDT è stato calcolato (D). Tasso di crescita (C) lievito (pendenza) è stato calcolato variazioni di OD 600 di 10 punti consecutivi di tempo (supponendo di linearità) nel corso del tempo di misurazione ore:. Il momento in cui è stato avviato il calcolo. (D) Il tempo necessario per il lievito di raddoppiare è l'inverso della pendenza da (C) (1 / Slope) MDT:. Il tempo di raddoppio minima calcolata (in ore).
Figura 2. MDTcalc schermata iniziale: sezione protocollo 5.1. Valori di input tipici da inserire sono mostrati.
Figura 4. Misura velocità di degradazione relative di Deg1 -Vu in Ubc7 ceppi mutanti sinistra:. Trama dei trasformati OD 600 valori, misurati durante la replica di w ild-tipo, ubc7 Δ e mutanti Ubc7 indicati, in funzione del tempo. Le cellule che esprimono Deg1 -Vu sono state coltivate su SD-URA medio e OD 600 è stata misurata ogni ~ 15 min. A destra: La MDT per ogni ceppo è stato calcolato utilizzando MDTcalc.
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Figura 5. Un test ad alta velocità per l'identificazione e l'isolamento di nuovi degrons. (A) Rappresentazione schematica delle caratteristiche del giornalista URA3-GFP-cDNA. (B) Un diagramma di flusso che descrive le fasi sperimentali per l'isolamento di ceppi di lievito che trasportano un degron. La libreria plasmide descritto in A è stato trasformato in cellule Try467, seguite da selezione su piastre SD-Leu. Le colonie sono stati replicati alle piastre SD-Leu contenenti 5-FOA e le colonie a crescita rapida sono stati raccolti e organizzati su piatti in un array ordinato. (C) Colonie esprimere URA3-GFP-cDNA che cresceva su piastre contenenti 5-FOA sono state incubate in entrambi i mezzi per 20 ore SD-LEU o SD-URA. OD 600 è stata misurata ogni ~ 15 min e il tempo minimo di lievito raddoppio (MDT) è stata calcolata utilizzando il software MDTcalc n degron:. Un plasmide che esprime URA3-GFP senza degron, serve come controllo positivo per growth Linea rossa:. soglia stabilita dal valore MDT del controllo.
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Discussion
Qui si descrive un saggio basato sulla crescita delle cellule per la determinazione del tasso di degradazione delle proteine relativi, definiti "la cinetica di crescita in coltura liquida in condizioni selettiva" (Gils). Il test Gils ha diversi vantaggi: è semplice da configurare, l'acquisizione dei dati e l'analisi è semplice ed è estremamente modulare. Di conseguenza, Gils può essere applicata contemporaneamente a più campioni in un facile da usare formato di piastra multi-bene che può essere adattato per automazione per applicazioni ad alta produttività. Ancora più importante, Gils fornisce dati altamente riproducibili, quantitativi e robusti ed è più flessibile di agar-piastra saggi di crescita based che selezionano per la crescita positivo / negativo. Inoltre, Gils è molto sensibile in quanto in grado di rilevare piccole variazioni di velocità di degradazione delle proteine o dei livelli di steady-state, che riflette l'attività dei componenti o degrons UPS rilevanti. Infine, saggi Gils richiedono periodi di crescita significativamente più brevi (<12 ore) rispetto al growth saggi su piastre di agar (in genere 2-4 giorni).
Mentre il saggio Gils è molto utile per studiare la degradazione delle proteine, diverse considerazioni importanti devono essere prese in considerazione. Ad esempio, è indispensabile utilizzare un ceppo di lievito sfondo isogenico causa di caratteristiche di crescita ceppo-specifici. Inoltre, per verificare la validità del test, ogni test deve essere ripetuto almeno tre volte in condizioni identiche, cosa più importante, la densità iniziale delle cellule (OD 600), temperatura di crescita e coltura cellulare intensità agitazione non dovrebbero essere modificate. Si raccomanda pertanto che il protocollo specifico test viene memorizzato nel software del lettore di micropiastre per usi ripetuti. Un ulteriore variabile da considerare è dove il degron è posizionato all'interno URA3. Come la posizione degron può determinare la sua funzione, il posizionamento sia a C 'o N' regioni devono essere testati empiricamente.
Calibrazione del giornalista protein livello di espressione è anche fondamentale per la riuscita applicazione del Gils. Un giornalista ottimale è quella che è efficiente degradato dal sistema in esame e conferisce così uracile Auxotrofia. Tuttavia, le variazioni di Auxotrofia dovrebbero rispecchiare fedelmente la stabilità giornalista. Questo può essere determinato empiricamente previo test della correlazione tra i tassi di proteina reporter di degradazione, determinate con metodi biochimici aggiuntivi e valori MDT, determinati da Gils (Figura 3B). Un problema comune sorge quando l'espressione stato stazionario basale di un reporter non raggiunge un livello di soglia e quindi è troppo basso per consentire la crescita su SD-URA anche quando è completamente stabilizzato. Tale problema può essere superato ponendo l'espressione giornalista sotto il controllo di un promotore inducibile che aumenta l'espressione della proteina basale senza influenzare degradazione. Promotore attività in tali sistemi deve essere finemente calibrata per evitare la crescita permanente sulla SD-URA a causa di high livelli di proteine e giornalista attività enzimatica anche quando è parzialmente degradata. I promotori e le condizioni di espressione descritte in questo studio sono stati scelti perché permettono regolamentazione sensibile dell'espressione proteica: MET25p e CUP1 p sono promotori metabolita indotta la cui attività può essere finemente sintonizzato attraverso il controllo della metionina e rame, rispettivamente (Tabella 3).
Controllo substrati giornalista di qualità (come quelli descritti in questo studio) possono formare aggregati intracellulari che potrebbero sequestrare URA3 e prevenire la sua funzione. In tal caso uracile Auxotrofia può essere erroneamente interpretata come il risultato della degradazione proteica. Per testare la tendenza delle diverse degrons aggregare, un reporter aggiuntiva deve essere impiegato. Ad esempio, il reporter URA3-GFP progettata per lo schermo degron (Figura 5A), consente la visualizzazione di aggregati intracellulari mediante microscopia a fluorescenza di cellule in crescita nel Presence di 5-FOA. Questi aggregati vengono visualizzati come denso focolai GFP che sono chiaramente distinguibili l'aspetto diffuso della proteina solubile (dati non riportati). Il reporter URA3-GFP-degron può essere usato in modo simile per determinare l'effetto della degron sulla proteina co-localizzazione e distribuzione subcellulare. Può essere utilizzato anche per seguire la degradazione di substrati selezionati mediante citometria a flusso, come schermo secondario 25.
Un vantaggio più significativo del metodo Gils è che è sufficientemente flessibile e quindi può essere facilmente adattato ad una varietà di applicazioni, oltre a quelle descritte nel presente documento. Ad esempio, il metodo può essere utilizzato anche per esaminare l'idoneità del proteasoma in varie condizioni. In questo caso, un substrato proteasoma non ubiquitylated come ornitina decarbossilasi (ODC) è fuso URA3. Il metodo può anche verificare la degradazione delle proteine nei compartimenti intracellulari distinte quando viene impiegato un segnale specifico di localizzazione.In questo studio Vma12 ancorato il reporter di ER-membrana (figure 3, 4). Analogamente, un segnale di localizzazione nucleare (NLS), segnale di ritenzione ER (KDEL) o citosol (assenza di un segnale specifico) può essere impiegato. Un sistema che consente l'analisi simultanea di degradazione delle proteine nei vari compartimenti intracellulari potrebbe avere un impatto profondo sulla nostra comprensione di come le reti di degradazione delle proteine funzionano. Infine, i principi del metodo di selezione può essere applicata alla ricerca di degradazione delle proteine in altri sistemi basati su cellule modello, dai batteri alle cellule umane, i quali richiedono il prodotto del gene URA3 per la sopravvivenza.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma - Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma - Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma - Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma - Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96-well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma - Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used. | |
| MDTcalc | Experimental software |
References
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