Summary
Brain myeloide celler karakterisering følgende slag kan utføres ved hjelp av optiske stereology fraksjoneringsmetoden, eller ved en strømningscytometrisk analyse av hjerne leukocytter suspensjoner. Begge er nyttige teknikker for å utføre en nøyaktig fenotypiske forskjellsbehandling av de viktigste myeloide celle undergrupper som finnes i iskemisk hjernen.
Abstract
Mikroglia aktivering, samt bloduttredelse av hematogen makrofager og nøytrofile, antas å spille en sentral rolle i hjerneskade etter hjerneslag. Disse myeloide celle subpopulasjoner kan vise ulike fenotyper og funksjoner, og må skilles og preget til å studere deres regulering og bidrag til vevsskade. Denne protokollen gir to ulike metoder for hjernen immun celle karakterisering: en presis stereological tilnærming og en flowcytometrisk analyse. Den stereological tilnærming er basert på den optiske fraksjoneringsmetoden, som beregner det totale antall celler i et område av interesse (infarkt hjernen) estimeres ved en systematisk stikkprøvekontroll. Den andre karakterisering tilnærmingen gir en enkel måte å isolere hjernen leukocytt-suspensjoner, og å karakterisere dem ved flowcytometri, som åpner for karakterisering av mikroglia, infiltrert monocytter og nøytrofile av iskemisk vev. I tillegg er det også details en cerebral iskemi modell i mus som utelukkende påvirker hjernens cortex, genererer svært reproduserbare infarkter med lav dødelighet, og prosedyren for histologisk hjernen behandling for å karakterisere infarktvolum ved Cavalieri metoden.
Introduction
Morfologiske, fenotypiske og genuttrykk endringer av mikroglia, samt bloduttredelse og aktivering av hematogen makrofager og nøytrofile antas å spille en sentral rolle i den patofysiologiske kaskade følgende hjerneskade 1-4. Denne protokollen gir to tilnærminger for å beregne antall forskjellige myeloid celle undergrupper av den iskemisk hjernen og å utføre sin fenotypisk karakterisering. I tillegg gir det også en beskrivelse av en eksperimentell modell av cerebral iskemi i mus, som består av den forbigående eller permanent ligation av både distal arteria cerebri media (MCA) og arteria carotis communis (CCA), inkludert hvordan å evaluere infarktet av den nøyaktige Cavalieri metode med en stereological programvare.
Den første metode for å karakterisere myeloide celleundergrupper av ischemisk hjerne er en stereological metode basert på den optiske fraksjonerings tilnærming 5. Dette er den mestbrukte stereological sonde i biovitenskap og gir en høy grad av presisjon med lave koeffisienter av feil 5-7. Dette er det beste valget for celle kvantifisering når vevet er skåret inn i seksjoner, som det unngår skjevhet på celle estimering på grunn av fragmentering av vevet inn i seksjoner. Denne metoden er en svært effektiv måte å karakterisere tall, dynamikk og fenotypiske endringer av infiltrert nøytrofile subpopulasjoner av iskemisk vev 8.
Den andre karakterisering tilnærming er basert på en modifisert protokoll fra Campanella og medarbeidere 9 som gir en enkel måte å isolere hjerne leukocytt-suspensjoner, og å karakterisere dem ved strømningscytometri. I motsetning til konvensjonelle immunhistokjemiske teknikker, flowcytometri karakterisering tillater skille mellom mikroglia (CD45 lo CD11b +) og infiltrert myeloide celler (CD45 hi CD11b +) basert på deres different uttrykk nivåer av CD45 9-13. I tillegg proinflammatoriske monocytter (CD45 hi CD11b + Ly-6G - Ly-6C hi), nøytrofile (CD45 hi CD11b + Ly-6G +) og andre leukocytter undergrupper av den iskemisk vev kan skilles. Denne tilnærmingen gir en pålitelig og rask analyse for å vurdere nevroinflammasjon i eksperimentelle modeller med hjerneiskemi. Imidlertid kan behandlingen vev påvirke aktiveringstilstand, og numrene til de forskjellige cellepopulasjoner som finnes i ischemisk vev og gir en semi-kvantitativ karakterisering.
Protocol
MERK: Alle eksperimentelle protokoller følges retningslinjene i dyrevern komiteen av Universidad Complutense (etter EU-direktivene 86/609 / CEE og 2003/65 / CE).
1. hjerneiskemi Model
MERK: cerebral iskemi modell i denne artikkelen innebærer permanent eller forbigående okklusjon av både CCA (arteria carotis communis) og MCA (midten cerebral arterie) ved ligering med en nylon sutur.
- Pre-kirurgiske preparater
- Steriliser alle kirurgiske instrumenter ved autoklave eller med et glass perle sterilisator. Desinfisere den kirurgiske området med 70% etanol i tillegg.
- Anesthetize mus med passende anestetika. Oppnå induksjon av isofluran 2,5% og vedlikeholde med isofluran med 1,5% i en blanding av 80% luft / 20% oksygen ved bruk av en fordamper. Påfør kunstige tårer til musene øynene for å hindre tørrhet mens under narkose.
- Plasser musen på en varmepute som er knyttet til et gebyrdback enhet med en temperaturføler plassert i rektum og innstilt temperatur på fysiologiske nivåer (36,5 ± 0,5 ° C) i løpet av den kirurgiske prosedyren.
- Arteria carotis communis okklusjon ved ligering
- Plasser musen i ryggleie, og immobilisere med tape. Desinfiser huden med 70% etanol eller povidon-jod og klippe håret av øvre ventral del.
- Under et kirurgisk mikroskop, foreta en 1 cm midtlinjesnitt rundt den ventrale overflate av halsen.
- Trekk fra hverandre alt mykt vev (kjertelvev inkludert sub-overkjevens, sublingual og ørespyttkjertler) og identifiserer den venstre arteria carotis communis (CCA), som er lokalisert lateralt i forhold til trakea. Trekk inn musklene og eksponere venstre CCA. Nøye dissekere fra nervus vagus.
- Når dissekert, okkludere venstre CCA av en ligatur hjelp av en 6/0 nylon sutur. Ligere med en fast knute eller en knot (for å tillate reperfusjon om en forbigående cerebral ischemi-modellen er ønsket).
- Plasser kjertelvevet i sin opprinnelige posisjon og lukke såret på halsen huden med en 6/0 nylon sutur.
MERK: Sham dyr blir utsatt for det samme kirurgiske prosedyren som MCAO dyr men CCA er ikke tilstoppet.
- Distal tilstopping av midtre cerebralarterie ved ligering
- Plasser musen på sin høyre side og immobilisere med tape. Desinfiser hodet huden med 70% etanol eller povidon-jod og klippe håret av musen hodet (fjerne hår etter klipping).
- Under et kirurgisk mikroskop, gjør et snitt i huden mellom øyet og øret. Flytt huden bort og hold den med tape.
- Lage en horisontal snitt på timelige muskel fra høyre til venstre. Deretter gjør en annen vertikal snitt på høyre side av den timelige muskel (være forsiktig for å unngå kutt timelig vene). Trekk fra hverandre tinningmuskelen fra skallen og hold den med en sutur for å opprettholde en ren skallen overflaten.
- Rengjør skallen overflatenmed kaldt sterilt saltvann for å oppdage den nøyaktige plasseringen av venstre arteria cerebri media (MCA) via skallen åpenhet. Utføre en runde kraniotomi (1 mm i diameter) med en rustfritt stål Burr i frontallappen mellom zygomatic buen og squamosal bein. Fjern nøye skallen og utsett MCA.
- Anvende en liten mengde kald steril saltoppløsning til overflaten av hjernen og fjerne hjernehinnene (dura mater og arachnoid) ved hjelp av tang.
- Utføre ligation av venstre MCA i distal bagasjerommet like før forgreningen mellom frontal og bakre MCA grener. Okkludere venstre MCA av en ligatur hjelp av en 9/0 nylon sutur. Ligere med en fast knute eller en knot (for å tillate reperfusjon om en forbigående cerebral ischemi-modellen er ønsket). Tidsperioden mellom CCA og MCA okklusjon er ca 10-20 minutter avhengig av operatørens erfaring.
- Plasser den time muskel i sin opprinnelige posisjon og lukk incision på halsen huden med en 6/0 nylon sutur.
- Returnere musen til buret for å gjenopprette fra anestesi (vanligvis 5-10 min) og injisere mus med buprenorfin intraperitoneal (IP) (0,3 mg / kg).
- Overvåke musen for flere timer for å oppdage eventuelle ubehag (ikke la musen uten tilsyn før den har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternum recumbency). Siden post-kirurgisk vekt tapt er vanligvis observert, plasserer most mat i en petriskål til rette for å spise.
- Når dyret er fullt restituert, tilbake til selskap med andre dyr.
- Hvis en transient MCAO-modell er ønsket, bedøve musen igjen og fjerne knot av CCA og MCA å tillate reperfusjon (vanligvis mellom 0,5-2 timer (figur 1)).
MERK: Sham dyrene blir utsatt for det samme kirurgiske prosedyren som MCAO dyr, men MCA ikke er okkludert.
2. Perfusjons og sectioning av hjernevev
- 24 eller 48 timer etter MCAO, ofre musen med en dødelig dose av bedøvelse (for eksempel, natrium pentobarbital, IP 86 mg / kg eller en overdose med isofluran).
- Perfuse musen med fosfatbuffer 0,1 M, etterfulgt av 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffer (pH 7,4).
- Fjern hjernen som følger:
- Halshogge dyret like over ryggmargen.
- Lag en posterior-anterior snitt på hodet hud for å avsløre skallen. Lag to laterale kutt i krysset av sideveggene og bunnen av hodeskallen og fjerne den lille stykke bein.
- Gjør et kutt gjennom skallen langs sagittal sutur.
- Fjern skallen liggende hver halvkule ved hjelp av en tang for å eksponere hjernen. Bruk en slikkepott til å skille hjernen fra skallen og overføre den til 4% PFA løsning.
- Post-fix i 3 timer i 4% PFA løsning ved 4 ºC.
- Fjern PFA løsning og incubate hjernen i 48 timer i 30% sukrose-løsning for å cryoprotect hjernen.
- Fjern sukroseløsning og fryse hjernen raskt i kaldt isopentan (-40 ºC). Butikken frosset hjernen ved -80 ºC.
- Skaff koronale hjernen seksjoner (30 mikrometer) med et fryse mikrotom. Samle ti serie sett i en cryopreserveringsmiddel løsning. Hver serie sett består av rundt 14-16 koronale skiver med en interslice avstand på 300 mikrometer som tilstrekkelig smake på mus hjernen mellom 1,94 og -2,46 posterior til bregma.
3. Nissl Farging og infarktvolum Estimering
- Nissl farging av cresylfiolett
- Mount hjerne seksjoner i en Superfrost objektglass. For infarktvolum bestemmelse av Cavalieri metode i Nissl-farget seksjoner, bruk en 1/20 skive-sampling fraksjon (1/2 deler av en av de ti serie sett i trinna 2.7, ca, et totalt antall på 7-8 seksjoner med en interslice avstand på 600 μ; M er brukt). Vær nøye med å opprettholde riktig anterior-posterior orientering (infarktområdet er plassert på høyre side).
- Utføre konvensjonell Nissl-farging som følger:
- Tillate lysbildemonterte deler tørke i flere timer.
- Rehydrere lysbildemontert seksjoner og beis med 0,1% cresylfiolett løsning for 5 min.
- Dehydrerer med en gradert serie av EtOH (70%, 90% og 100%, 5 min per endring). Rengjør glidemonterte seksjoner med xylen, legge distrene-80 mykner xylen (DPX) monterings media og dekk med et glass dekkglass.
- Ved hjelp stereological programvare for å anslå infarktvolum ved Cavalieri metode i Nissl-farget seriesnitt
- Bruk parametere er vist i tabell 1 for å kvantifisere infarktvolum av Cavalieri fremgangsmåte 14 og en stereology system, som består av et mikroskop utstyrt med et kamera, et XYZ motorisert datatrinn og stereological programvare (Hovedanvisningene nedenfor er relatert til PC-er, men skiltene kan variere for andre operativsystemer).
- Slå på PC, mikroskop, scene kontroller og kamera i riktig rekkefølge. Start stereological programvare.
- Flytt 10X objektiv på plass og velg 10X fra den objektive rullegardinmenyen.
- Flytt rundt den første Nissl-farget delen og finne et egnet referansepunkt. Klikk med musen for å etablere referansepunktet (for å flytte rundt det er nødvendig å aktivt gleden gratis knappen).
- Anslå "monterte delen tykkelse" (selve delen tykkelse tar hensyn til krymping). Trykk på "Focus Position Meter" -knappen og beregne tykkelsen fra bunnen til toppen av seksjonen.
- Lag en kontur verktøy for contralesional og ipsilesional områdene, og infarktområdet.
- Klikk på menyen "Vis" og velg "Skjerminnstillinger". Dette åpner than Skjerm Dialog innstillinger.
- Velg "Konturer" og klikk på knappen "legg Contour type".
- Lag en kontur for hver region for å kvantifisere og gjøre dem synlige i konturen gardinmenyen. Klikk på OK.
- Lag en markør verktøy for contralesional og ipsilesional halvkuler og infarktområdet.
- Klikk på menyen "Vis" og velg "Skjerminnstillinger" for å åpne dialogboksen Skjerminnstillinger.
- Velg "markører" -kategorien og endre markører nevne ved å dobbeltklikke i løpet av de tilgjengelige markører. Gjøre dem synlige i Marker Bar. Klikk på OK.
- Aktiver seksjonsleder.
- Klikk på menyen "Verktøy / Serie Seksjon Manager". Legg til en ny seksjon med den "nye delen" -knappen. Denne knappen åpner "Serial Seksjon dialogboksen Setup".
- Still "Block Advance" som 30 mikrometer. Still"Montert seksjon tykkelse" med verdien estimert i trinn 3.2.5.
- Still "Evaluering Intervall" som 20. Bruk en 1/20 skive prøvetaking brøkdel.
- Set "seksjonsnummeret starter" som 1. Still "Z-aksen verdi for toppen av den første delen" som 0. Klikk på OK.
- Tegne en kontur å skissere den kontralaterale halvkule.
- Velg Contralesional halvkule verktøy (tidligere opprettet i trinnet 3.2.6) fra konturen gardinmenyen.
- Tegne en kontur å skissere den kontralaterale halvkule.
- For å avslutte sporing contralesional halvkule, høyreklikk på musen og velg "nær kontur".
- Anslå contralesional halvkule konturen av Cavalieri.
- Klikk på menyen "prober" og velg Cavalieri Estimator. Still "Grid Spacing" som 100 mikrometer. Still "Grid Rotering" som 0. Still "Blåse Advance "som 30 mikrometer. Klikk på OK.
- Velg "The contralesional halvkule" -knappen fra Markører Bar. Høyreklikk innsiden av Contralesional halvkule kontur.
- Velg "Paint Cavalieri Markers Mode". Høyreklikk inne i contralesional halvkule kontur igjen og velg "Paint Markører i Contour".
- Deaktiver Cavalieri Estimator ved å klikke på prober og Cavalieri Estimator og deaktivere contralesional markør knappen fra markør bar.
- Gjenta samme prosedyre for ipsilesional halvkule og infarktområdet (trinn 3.2.7 og 3.2.8). Lagre data etter estimering av arealet i hver seksjon.
- Beregn kontralaterale, ipsilesional og infarcted områder i resten av Nissl-farget delen.
- Lag en ny seksjon som i trinn 3.2.6. Ikke endre verdiene angitt i "Serial seksjon Setup" dialogen. Klikk på OK.
- Gjenta trinn 3.2.7-3.2.8 i den nye delen.
- Eksportere resultatene av kvantifisering til et regneark.
- Klikk "prober" i Stereo Investigator Meny. Velg "Display Probe Run List". Dette åpner "Forrige Stereological Kjører Dialog".
- Velg alle delene ved å klikke på dem. Trykk på "Vis resultater" Button. Dette åpner "Cavalieri Estimator Resultater" der det beregnet areal og volum for hver region vises.
- Å eksportere resultatene til et regneark-fil, klikker du på "Kopier alle resultater til utklippstavlen" og lime til en Excel-fil med de viktigste resultatene fra hver region (tabell 2).
- Express infarktvolum som mm 3 eller som% av halvkulen som er infarkt (% IH) ved hjelp av formel 15% IH = InfVol / ContrVol * 100, hvor
ContrVol (Contralesional halvkule Volume) = ΣContrArea jeg
4. Stereological Kvantifisering av infiltrert Nøytrofiler Etter Cerebral iskemi av den optiske parerings
- Farging av hjernen seksjoner:
- For å anslå det totale antall infiltrerte nøytrofiler etter MCAO av den optiske fraksjoneringskolonnen 16, bruk av et 1/10 skive samplings fraksjon. Immunfarging av nøytrofile ved hjelp av konvensjonelle immunfluorescens teknikker med rotte anti-Ly6G antistoff (1A8) og retten sekundært antistoff på frittflytende seksjoner. I tillegg er en kontra med et atomtrakter som DAPI eller TOPRO, selv om det ikke er nødvendig for nøytrofil identifikasjon, kan gjøre det enklere å detektere infarktområdet.
- Mount hjerne seksjoner i en Superfrost objektglass med infarktområdet plassert i høyre side.
- Quantificasjon av infiltrerte leukosytter i den ischemiske hjerne av den optiske fraksjonerings
- Bruk parametere er vist i tabell 3 for å kvantifisere infiltrert leukocytter i den ischemiske hjerne av den optiske fraksjonerings tilnærming med en stereology system. Gjenta trinnene 3.2.1-3.2.5 fra § 3.
- Opprette en kontur verktøy for infarktområdet som det er blitt beskrevet i trinn 3.2.6 av seksjonen 3.
- Lag en markør verktøy for nøytrofile som det har blitt beskrevet i trinn 3.2.7 av § 3.
- Aktiver seksjonssjef og opprette en ny seksjon som i trinn 3.2.8. I dette tilfellet, sett "Evaluering Intervall" som 10 (en 1/10 skive prøvetaking brøkdel brukes for å estimere nøytrofile nummer).
- Velg "infarktområdet" contour verktøy (tidligere opprettet i trinnet 4.2.1) fra konturen gardinmenyen. Tegne en kontur å skissere infarktområdet på 10X objektiv. Endre målet til 100X å utføre neutrophil kvantifisering (ikke glem å velge 100X fra den objektive rullegardinmenyen).
- Klikk på menyen "prober" og velg "Optical parerings". Still "XY Plassering av å telle Frames" som 230 for både X og Y grid størrelse. Still "Grid Rotering" som 0. Still "Block Advance" som 30 mikrometer. Klikk på OK.
- Velg "nøytrofile" -knappen fra Marker Bar. Mark farget nøytrofile i infarktområdet. Når finish, deaktivere den optiske parerings sonde ved å klikke på "prober" og "Optical parerings". Deaktivere nøytrofile knappen fra markør bar.
- Gjenta samme prosedyre for hver seksjon (4.2.4-4.2.9).
- Eksportere resultatene av kvantifisering til et regneark.
- Klikk "prober" i Stereo Investigator Meny. Velg "Vis Probe Run List" for å åpne "Tidligere Stereological Runs"dialog.
- Velg alle delene ved å klikke på dem. Trykk på "Vis resultater" for å åpne "Optical fraksjonerings Resultater" der estimert antall nøytrofile vises.
- Eksportere resultatene til et regneark-fil ved å klikke på «Kopier alle resultater til utklippstavlen" og lime inn i et regneark.
5. Brain Dissosiasjon og flowcytometrisystemer Analyse
MERK: myelogen subpopulasjon karakterisering ved flowcytometri på friskt hjernevev kan brukes som et alternativ til det foregående nøytrofile karakterisering utført på faste og immunostained hjerneseksjoner.
- Brain dissosiasjon og enkeltcellesuspensjon fremstillingen
- Gjør 10 ml / dyr av en RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) -Percoll oppløsning inneholdende 8 ml RPMI, 1 ml 30% Percoll og 1 ml av en 10 x PBS (fosfatbufret saltvann).
- REDra musehjerne etter MCAO som beskrevet i trinn 2.3.
- Under et mikroskop, dissekere ut kjernen og peri-infarkt områder av ipsilaterale cortex fra hjernen iskemisk mus (eller en lignende region for humbug og naive dyr) fra hjernen. Vekt hjernevev og plassere den i 5 ml iskald RPMI-Percoll® (vekten trinnet kan utføres for normalisering mellom eksperimentelle grupper).
- Dissosiere vevet i en enkelt cellesuspensjon ved bruk av en Potter-Elvehjem-typen vevsmaler med teflon pistiller.
- Overfør cellesuspensjoner i et 50 ml ultrasentrifugerør og tilsett 5 flere ml RPMI-Percoll-løsning til prøvene.
- Sentrifuger cellesuspensjoner ved 7800 xg i 30 min ved 25 ° C. Etter sentrifugering sikrer en hvit-farget lag svarende til myelin vises på toppen av løsningen.
- Fjern myelin lag nøye og filtrere hele cellesuspensjoner, inkludert de pelleterte celler, gjennom en 40-mikrometer nylonnetting strainer.
- Tilsett 10 ml RPMI på silen for å sikre at alle cellene blir filtrert og plassere løsningen i et 50 ml rør. Tilsett 30 ml RPMI og sentrifuger på 50 ml av cellesuspensjonen ved 600 xg i 10 min ved RT.
- Kast supernatanten og resuspender leukocytt pellet med 1 ml PBS. Tilsett 4 ml lyseringsbuffer (150 mM NH4CI, 10 mM NaHCO3 og 0,1 mM EDTA) og inkuberes cellene i 2-3 minutter ved romtemperatur for å lysere erytrocytter fra cellesuspensjonen. Sentrifuger oppløsningen ved 600 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Cellefarging og flowcytometri
- Tilbered en merking cocktail for flowcytometri, inneholdende 200 ul av PBS-BSA (1%) 1: 100 Fc-Block, 1:40 anti-CD45-PercP rotte, 1:40 anti-Ly6G-APC rotte, 1:40 anti CD11b-FITC rotte og 01:40 anti-Ly-6C-PE rotte per prøve.
- Resuspender cellene i merking cocktail og prøvene inkuberes i 45 min på is.
- Vask merking cocktailmed 1 ml kald PBS og sentrifuger cellene ved 600 x g i 10 min ved 4 ° C. Resuspender pelleten med 100 ul FACS-Flow og skaffe hele cellesuspensjonen ved strømningscytometri.
- Bruk en flowcytometri analyse programvare for å karakterisere og kvantifisere celle populasjoner.
- Hoved leukocytter undergrupper som tilsvarer merking cocktail utarbeidet i denne protokollen kan karakteriseres som følger: CD45 lo CD11b +: bosatt mikrogliaceller celler; CD45 hi CD11b + Ly-6G +: nøytrofile; CD45 hi CD11b + Ly-6G - Ly-6C hi: proinflammatoriske monocytter.
Representative Results
Cerebral ischemi-modellen er vist her genererer infarkter sett utelukkende i cortex uten å påvirke de striatale vev ettersom lenticulostriatal grener av MCA at vanne striatum ikke er okkludert (figur 1). Av Nissl-farging, kan det skadede område kan identifiseres som en hypochromic kortikale område (figur 2). Denne modellen er karakterisert ved svært reproduserbare infarktvolum på 24 timer etter MCAO (IH 15,89% ± 0,28) estimeres ved Cavalieri fremgangsmåte Nissl-fargede seksjoner (figur 2). Estimering av infarktvolum ved Cavalieri metoden er en nøyaktig tilnærming med en lav feil som gjenspeiles i koeffisienten for feil (CE) på Gundersen i contralesional og ipsilesional halvkuler, så vel som i infarktområdet (Tabell 2). Skadet vev volum kan uttrykkes i mm 3, men også som% IH hjelp av formelen i avsnitt 3.2.13. I tillegg estimeringenav det totale volum av de ipsilesional og contralesional regioner muliggjør beregning av ødem indeks for å korrigere infarktvolum og for å unngå en overestimering av det skadede vev (tabell 2).
Gitt den serielle snitte behandling av hjernevevet, kan dette bli utnyttet for å gjennomføre en nøyaktig beregning av det totale antall av cellepopulasjoner, som infiltreres neutrofiler, i det ischemiske område ved hjelp av optisk pareringsmetoden (Figur 3 og Tabell 4) med parametre er vist i Tabell 3. Denne protokollen estimerer et totalt antall nøytrofile (Ly6G-positive celler) i infarktområdet 23.328 ± 3.623 etter 24 t og 82 856 ± 8 143 i 48 timer hos mus etter pMCAO (figur 3D). I samsvar med tidligere studier, nøytrofile infiltrasjon direkte korrelert med infarktstørrelse (Figur 3E). Estimering av tHan antallet nøytrofiler ved optisk pareringsmetode er en nøyaktig tilnærming med en lav feil som reflekteres av CE i Gundersen (tabell 4).
Leukocytt-isolering og karakterisering flowcytometri protokollen tillater isolering av 47.922 ± 23.174 myeloide celler fra cortex av ipsilesional halvkule av iskemiske musene. Dette utgjør 10-30% av de totale arrangement som finnes i cellesuspensjonen. De aller fleste av fangede hendelser ved hjelp av denne protokollen til stede en lav FSC parameter, tilknyttet mobilnettet rusk (figur 4). CD11b farging viser at CD11b + celler har en høyere FSC verdi (figur 4), noe som tyder på at cellerester ikke er merket med denne markør og, som tidligere antydet, at det kan bli utelukket fra videre analyse ved å sette FSC terskelen ved 200 ni. Den variable mengde celleavfall oppnådd med denne metoden antyder at avvik på prøve prosessing (timing, vev bevaring, prøvetemperatur, effektiv myelin fjerning, etc.) kan gjøre rede for det. I tillegg er bruken av celle siler også nødvendig for å unngå tilstedeværelse av cellulære klemmer i prøvene; Dette trinn må utføres før cellefarging. Ved hjelp av portstyringsstrategi er vist i figur 5 som er basert på CD11b og CD45-ekspresjon, kan vi skjelne mellom beboer og infiltrert myeloide celler i ischemisk vev. Dette CD11b + befolkningen øker i den ischemiske hjernehalvdelen når sammenlignet med den naive og med sham-gruppe, hvor disse celler er stort sett knyttet til en lav ekspresjon av CD45 som indikerer at mikroglia er prolifererende etter ischemi (figur 4, figur 5 og tabell 5) . Denne forskjellen skyldes sannsynligvis celleinfiltrasjon fra periferien, noe som gjenspeiles av utseendet på en CD11b + CD45 hi celle subpopulasjon i iskemisk hjernen (figur 4Figur 5 og Tabell 5) som er lavt antall i naive og i humbug hjerner. Bidraget av infiltrater til CD11b + cellepopulasjonen i hjernen iskemi er en meget dynamisk prosess fire. I MCAO-modell av ligaturen, kan den variere fra 30% til 60% av de totale CD11b + celler, avhengig av størrelsen på lesjonen og av tiden når den karakteriseringen er blitt utført. Nøytrofile, karakterisert som Ly-6G + celler, er den mest tallrike infiltrert cellepopulasjon funnet på 24 timer etter MCAO i iskemisk mus hjernen ved hjelp av denne modellen av cerebral iskemi, som de utgjør 70-80% av CD11b + CD45 hi. Resten av cellene er stort sett en undergruppe av CD11b + CD45 hi Ly-6G - Ly-6C hi proinflammatoriske monocytter. I denne modellen vil denne populasjonen øker i antall i de iskemiske hjerneområder 24-48 timer etter MCAO.
Fig. 1: Kirurgisk prosedyre for MCA ligering (A) Etter tilbaketrekkingen av den temporale muskel, er en liten kraniotomi utført i mus skallen. MCA er ligert av en knute eller en slipknot ved hjelp av en 9/0 sutur. (B) Representative bilder av kortikale lesjon generert av MCAO modell. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kvantifisering av infarktvolum med Cavalieri. (A) Representative bilder av Nissl-farget hjerne seksjoner 24 timer etter permanent MCA ligation. Den høye forstørrelse viser hipocromatic området etter Nissl flekker somidentifiserer det skadede området (kjerne) etter MCAO. Peri-infarkt (PI) regionen er også vist. (B) Kvantifisering av infarktvolum representert som% infarkt halvkule (% IH) ved hjelp av Cavalieri metoden i serie Nissl-fargede seksjoner, 24 timer etter MCAO (n = 50 mus ).
Figur 3: Stereological kvantifisering av nøytrofile i infarktområdet 24 og 48 timer etter ligation, ved hjelp av den optiske pareringsmetode. (A) Representative bilde av infiltrerte neutrofiler (Ly6G-positive celler) i det ischemiske området ved 24 timer etter MCAO. Avgrensningen viser infarktområdet. (B, C) Eksempler på en optisk Dissector for kvantifisering av nøytrofil den optiske fraksjonerings. (D) Kvantifisering av totalt antall nøytrofile i infarkt region ved 24 og 48 timer (n = 4 mus). (E)Korrelasjon mellom antall nøytrofile med infarktstørrelsen ved 24 og 48 timer etter at MCA ligation. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 4: Representative dot-plot sprednings analyse av hjerne leukocytter erholdt fra naive, forloren og iskemisk (24 timer etter MCAO) halvkuler på basis av fysiske parametere (SSC og FSC) En populasjon av hendelser som uttrykker CD11b (rød) ble identifisert i alle grupper. Denne populasjonen var gated og karakterisert i henhold til uttrykk av CD45. Celler som uttrykker lave nivåer av CD45 (grønn) var tilstede i den iskemiske og ikke-iskemiske hjernebark og tilsvarte mikrogliale celler. I kontrast, celler som uttrykker høye nivåer av CD45 (gul) var barefunnet i iskemisk halvkule og i mindre grad i humbug gruppe. Videre analyse av CD11b + CD45 hi befolkningen viser at nøytrofiler (Ly-6G + celler, blå) og proinflammatoriske monocytter (Ly-6C hi celler, oransje) er de viktigste celle subpopulasjoner som finnes i hjernen infiltrerer 24 timer etter hjerneslag. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 5: Avblending strategier for å skille bosatt fra infiltrert myeloide celler i ischemisk vev CD11b + celle ble først gated ifølge isotype fluorescensintensitet (A). En representant prikkplott av cellesuspensjoner av iskemisk hjernen vises i opp til høyre i panelet. IVidere typiske verdier for det totale antall av hendelser, og for antall CD11b + hendelsene innsamlet ved hjelp av denne teknikk er vist (ingen celler / iskemisk hjernehalvdel;. (A) CD45 fluorescensintensitet analyse av CD11b + celler er vist i panel B. En representant prikkplott analyse av CD45 og CD11b uttrykk for gated CD11b + subpopulasjonen vises i opp til høyre i panelet. I tillegg er den typiske antall CD45 lo CD45 hi celler ervervet per iskemisk hjernehalvdel ved hjelp av denne teknikken vises (B).
| Parametrene som brukes for Cavalieri metode | |
| Seksjon Tykkelse (t) | 30 mikrometer |
| Objektiv | 10X |
| Slice prøvetaking fraksjon (SSF) | 1/ 20 |
| Avstand mellom seksjonene | 600 mikrometer |
| Grid Spacing | 100 mikrometer |
Tabell 1: Parametere brukt for stereological kvantifisering av infarkt vev.
| Resultater | Contralesional | Ipsilesional | Infarkt |
| Område (μm²) | 151460000 | 155060000 | 22600000 |
| Volum (μm³) | 90876000000 | 93036000000 | 13560000000 |
| Volum Korrigert for Over Projection (μm³) | 89957100000 | 92046300000 | <strong> 13416600000 |
| Koeffisient av Feil (Gundersen), m = 0 | 0,068 | 0.077 | 0,067 |
| Koeffisient av Feil (Gundersen), m = 1 | 0,015 | 0,017 | 0,015 |
| Koeffisient av Feil (Gundersen), alfa (q) | 0,068 | 0.077 | 0,067 |
| % Infarkt halvkule | 14.90 | ||
| Hjerne ødem (Ips Vol / Cont Vol) | 1,02 | ||
Tabell 2: Representative eksempler på contralesional, ipsilesional og infarktvolum ved Cavalieri metoden bruker Stereo Investigator Software.
| Parametere brukt for The Optical fraksjonerings | |
| Seksjon Tykkelse (TSF) | 30 mikrometer |
| Objektiv | 100X |
| Slice prøvetaking fraksjon (SSF) | 1/10 |
| Telle Frame Høyde | 40 mikrometer |
| Telle Frame Bredde | 40 mikrometer |
| X grid størrelse | 230 mikrometer |
| X grid størrelse | 230 mikrometer |
| Sikker Guard | 2 mikrometer |
| Optisk Disector Høyde | 14 mikrometer |
Tabell 3: Parametere brukt for stereological kvantifisering av infiltrert nøytrofile etter hjerneiskemi med den optiske fraksjonerings sonde ved hjelp av Stereo Investigator Software.
| Estimering av Nøytrofiler av den optiske parerings | |
| Antall prøvetakings nettsteder | 430 |
| Shape Factor | 6.24 |
| Totalt markører Telles | 166 |
| Estimerte Nøytrofiler av Optical parerings | 117,608.03 |
| Koeffisient av Feil (Gundersen), m = 0 | 0,22 |
| Koeffisient av Feil (Gundersen), m = 1 | 0.09 |
Tabell 4: Representant eksempel på de estimerte infiltrert nøytrofile etter hjerneiskemi med den optiske parerings sonde ved hjelp av Stereo Investigator Software.
| CD11b + | Nøytrofile | Monocytter | Mikroglia | |
| Naive | 25863 ± 4,575.8 | 473 ± 75,8 | 525 ± 191,4 | 19012 ± 1523 |
| Sham 24-timers | 24563 ± 5263 | 873 ± 192,5 | 1124 ± 391,5 | 23734 ± 2910 |
| pMCAO 24-timers | 47922 ± 23174 | 4874 ± 748,7 | 4826 ± 1345 | 35395 ± 10833 |
Tabell 5: Representative resultatene av de estimerte myeloide celler etter hjerneiskemi med Flowcytometri tilnærming.
Discussion
Cerebral iskemi modell introdusert her gir svært reproduserbare infarktvolum bestemmes 24-48 timer og 7 dager etter MCA ligation av ulike tilnærminger 8,15,17. Dette MCAO modellen har en lav dødelighet (mindre enn 1%) i forhold til andre, noe som minsker antall dyr som brukes i studier. Et kritisk punkt for å få denne lav dødelighet er å opprettholde riktig aseptiske forhold for å unngå infeksjoner som kan svekke overlevelse etter hjerneslag induksjon. Dette MCAO modellen kan ikke bare brukes som en permanent MCAO modell, som regnes som en klinisk relevant modell for translasjonsforskning 18, men også som en forbigående modell av forbigående ligering av CCA og MCA med en slipknot og posterior reperfusjon på ønsket tidspunkt 19. Denne metoden har blitt brukt i mus og rotter 17,20. Alt dette bevis indikerer at MCAO ved ligering er en høy allsidig modell av cerebral iskemi med flere programmer. En Critical trinn ved denne teknikk er at den krever invasiv kirurgi under et stereomikroskop; kraniotomi bør utføres svært nøye for å ikke å skade zygomatic bein samt MCA. Men bruken av narre dyr (er som utsettes for den kirurgiske fremgangsmåten, men CCA MCA og ligering utføres ikke) gir et nyttig verktøy for å diskriminere kirurgisk prosedyre avhengige effekter. Graden av hjerneskade etter denne teknikken kan kvantifiseres ved flere metoder. Vår protokoll for hjerne snitting Nissl-farging og etterfølgende beregning av volumet av Cavalieri muliggjør en nøyaktig kvantifisering av det skadede område, og reduserer antallet mus som brukes i denne type studier siden seriehjerneseksjoner kan også brukes for forskjellige immunhistokjemisk analyse. For en bedre ytelse av denne metodikken, er det avgjørende å velge de riktige parametrene som brukes i stereology programvare (tabell 1) som vil være nødvendig for å estimere the volumet av de forskjellige områder ved formelen: V = 1 / SSF * a f * t * ogOp i (SSF er stykket samplings fraksjon, t er den midlere tykkelse av seksjonene, er en f området av gitteravstanden og ogOp antall poeng treffer struktur).
Den distale MCAO ved ligering kan være nyttig for å karakterisere den infiltrerte leukocytt- og immuncelle subpopulasjoner 8,13 som deltar i den inflammatoriske prosessen etter hjerneskade 1-4. Her foreslår vi to ulike metoder for hjernen immun celle karakterisering, en presis stereological tilnærming og en flowcytometrisk analyse for bedre karakterisere flere leukocytter subpopulasjoner.
Å ta fordel av seriehjerne seksjonering, kan kvantifisering av totalt antall nøytrofile celler oppnås ved den optiske fraksjoneringsmetode 16 som beregner det totale antall celler i antallet celler samplet witha Systematisk Tilfeldig Samplet (SRS) sett med objektive virtuelle telling områder som dekker hele regionen av interesse, i vårt tilfelle infarktet regionen, med jevn avstand mellom objektive virtuelle telling mellomrom i retningene X, Y og Z. Denne metoden gir en nøyaktig verktøy for å anslå total nøytrofile tall i den ischemiske hjerne på forskjellige tidspunkter etter ligering. Selv om det ikke er vist i denne studien, kan denne protokollen også benyttes for beregning av de forskjellige nøytrofile subpopulasjoner etter iskemi 21 og for en nøyaktig kvantifisering av enhver annen cellepopulasjon som finnes i den ischemiske hjerne som andre infiltrerte leukocytter (monocytter / makrofager) og også for å estimere overlevende nevroner eller selv for neurogenesis kvantifisering etter hjerneslag. Den viktigste trinn for en nøyaktig estimering i det ønskede området er utvalget av de aktuelle parametere, som de som er vist i Tabell 3 for nøytrofil kvantifisering i den ischemiske området.Disse parameterne vil bli brukt for stereology programvare for å beregne den totale positive celletallet (N) ved å bruke ligningen N = ΣQ- x 1 / SSF x 1 / asf x 1 / TSF (ΣQ- er det totale antall celler tellet med fraksjonatoren, er SSF delen samplings fraksjon, asf er samplingsområdet fraksjon, og TSF er samplings fraksjon tykkelse) 5. Selv om denne metoden er langsommere enn andre kvantifisering teknikker (for eksempel analyse av nøytrofile markører ved mg vev, densitometri av representative bilder eller antallet nøytrofiler i hvert felt), har den fordel å være en objektiv og en fast teknikk som gir et presist kvantifisering av celleantallet.
Hjernen leukocytt isolasjon tilnærmingen muliggjør en simultan identifisering og kvantifisering av flere immun-celle-undertyper uten behov for å forspenne system ved in vivo-farging eller genetiske manipulasjoner. Påfølgende celle sortering fra preget myeloid populations eller deres immunomagnetisk separasjon kan brukes til flere nedstrøms applikasjoner, for eksempel videre studier på genet eller protein uttrykk. Den nøyaktige karakterisering av nøytrofiler, monocytter og mikroglia oppnådd med denne metoden gir høy spesifisitet med hensyn til eksisterende metoder slik som de immunhistokjemiske studier, en fordel som gjør det mulig å fordele spesifikke funksjoner til de forskjellige myeloide celler som medierer hjernen medfødte immunrespons. I tillegg kan den forlenges ytterligere å karakterisere andre hjerne populasjoner med det passende etikett, som blodbårne makrofager (CD11b + CD45 hi CD68 +), og det kan anvendes for studium av andre CNS-sykdommer eller skader. Derfor er denne teknikken gir et viktig verktøy for å utforske heterogenitet av den inflammatoriske respons i hjernen. En hovedbegrensning av denne teknikk ligger på fremstilling av leukocytt-suspensjoner fra friskt hjernevev, som kan forandreaktiveringstilstanden til cellene eller deres antigen endring. Selv om denne teknikken gir en mer detaljert kvalitativ karakterisering i forhold til immunhistokjemiske studier gir den en mindre nøyaktig kvantifisering basert på celleisolasjon. Til tross for dette, er effektiviteten av vår celle isolasjonsprotokoll lik andre publiserte metoder 9, og den kan effektivt brukes til å detektere forskjeller i antallet av hjerneimmunceller mellom kontroll og MCAO-grupper eller til og med mellom MCAO grupper som utsettes for forskjellige behandlinger 8.
Kritiske trinn i denne protokollen er vevet disseksjon, vevet avbrudd straffeprosess og myelin fjerning. Når det gjelder vev-samlingen, kan en normaliseringstrinn bli inkludert (ved veiing av vevet oppsamlet) for å unngå variasjoner på grunn av forskjellige disseksjon forestillinger. I tillegg kan normalisering mellom forskjellige MCAO-grupper også forekomme gjennom infarktvolum (tidligere bestemt ved magnetisk Resonance). En annen måte å løse dette problemet på er å bruke hele ipsilaterale hemisfæren av både ischemiske og kontrollgruppene, eller til og med bruke den kontralaterale hemisfære av iskemisk mus som en kontroll for å minimalisere antall dyr anvendt. Selv om denne løsning unngår forskjeller mellom hver disseksjon, den har en største ulempe; en fortynningsfaktor blir tilsatt ved å øke det totale antall celler, men ikke antall myeloide celler som utelukkende ligger i kjernen og peri-infarktområder av ipsilateral korteks. Angå vev avbrudd, illustrerer denne protokollen trinnene for mekanisk forstyrrelse av hjerneceller, unngå enzymatiske behandlinger og hindrer overflateantigen endring 9,22, en viktig sak for ytterligere kvalitativ og kvantitativ analyse av betennelsesceller undergruppene. I tillegg til fremstilling av cellesuspensjonen er av interesse, er myelin fjerning fra hjerneprøver et sterkt anbefalt trinn for å unngå interferens med downstReam programmer, for eksempel immunomagnetisk celle separasjon eller flowcytometri 23,24. Dette kan oppnås ved hjelp av forskjellige metoder, for eksempel sukrose eller Percoll gradienter, eller anti-myelin-perler. Her, og basert på tidligere studier som sammenligner ulike metoder for hjernecellesuspensjon isolasjon, mekanisk avbrudd i kombinasjon med Percoll® bruk for å fjerne myelin brukes til å forbedre celleutbytte og levedyktighet 25.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photonic Led F1 | WPI | 571329-8 | Equipment |
| Temp Controller | Panlab | HB 101/2 | Equipment |
| Volvere GX | NSK | Ne22L | Equipment |
| Microscope | WPI | PZMIII-BS | Equipment |
| Stainless Steel Burrs | FST | 19007-14 | Surgical material |
| Forceps Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | Surgical material |
| Forceps Dumont #5SF | FST | 11252-30 | Surgical material |
| Suture 6/0 | LorcaMarin | 55108 | Surgical material |
| Suture 9/0 | LorcaMarin | 61966 | Surgical material |
| Nikon Eclipse | Nikon | TE300 | Equipment |
| Isoflurane | Esteve | 571329-8 | Chemical |
| Sodium Pentobarbital | Vetoquinol | 570681 | Chemical |
| Freezing microtome | Leica Microsystems GmbH | SM2000R | Equipment |
| Superfrost slides | Thermo Scientific | 2014-07 | Lab material |
| Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | Chemical |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TE300 | Equipment |
| XYZ motorized computer stage and controller | Ludl electronics Products | Equipment | |
| Stereo Investigator System | Microbrightfield | Version 7.003 software | Software |
| 5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle | Thomas Scientific | 0913X70 | Lab Material |
| Polypropylene 50 ml Oak Ridge Centrifuge Tube | Nalgene | 3119-0050 | Lab material |
| Percoll | Sigma | p1644-100 | Chemical |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-702F | Chemical |
| Beckman Ultracentrifugue | Beckman Coulter | Equipment | |
| Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti | Beckman Coulter | Equipment | |
| BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron | BD | BD 352340 | Lab Material |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3733-500G | Reagment |
| FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi | 130-092-575 | Antibody |
| CD11b-FITC, human and mouse | Miltenyi | 130-098-085 | Antibody |
| CD45-PE, mouse | Miltenyi | 130-102-596 | Antibody |
| Anti-Ly-6G-APC, mouse | Miltenyi | 130-102-936 | Antibody |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C | Biolegend | 128012 | Antibody |
| BD FACS Flow | BD | 342003 | Reagment |
| BD FACSCalibur; 4-color | BD | 342975 | Equipment |
| BD Cell Quest Pro Software | BD | Software | |
| FlowJo software | Treestar inc. | Software |
References
- Chamorro, A., et al.
- Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nat Med. 17, 796-808 (2011).
- Ramlackhansingh, A. F., et al. Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury. Annals of Neurology. 70, 374-383 (2011).
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231, 482-497 (1991).
- Charleston, J. S. Estimating cell number in the central nervous system by stereological methods: the optical disector and fractionator. Current Protocols in Toxicology. 12 (Unit 12.6), (2001).
- Begega, A., et al. Unbiased estimation of the total number of nervous cells and volume of medial mammillary nucleus in humans. Experimental Gerontology. 34, 771-782 (1999).
- Cuartero, M. I., et al. N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARgamma Agonist Rosiglitazone. Stroke; a. Journal of Cerebral Circulation. 44 (12), 3498-3508 (2013).
- Campanella, M., Sciorati, C., Tarozzo, G., Beltramo, M. Flow cytometric analysis of inflammatory cells in ischemic rat brain. Stroke. 33, 586-592 (2002).
- Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells. Glia. 22, 72-85 (1998).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174 (2011).
- Denker, S. P., et al. Macrophages are comprised of resident brain microglia not infiltrating peripheral monocytes acutely after neonatal stroke. Journal of Neurochemistry. 100, 893-904 (2007).
- Ballesteros, I., et al. Rosiglitazone-induced CD36 up-regulation resolves inflammation by PPARgamma and 5-LO-dependent pathways. Journal of Leukocyte Biology. 95 (4), 587-598 (2013).
- Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. J Microsc. 150, 117-136 (1988).
- Hernández-Jiménez, M., et al. Silent Information Regulator 1 Protects the Brain Against Cerebral Ischemic Damage. Stroke. 44 (8), 2333-2337 (2013).
- Gundersen, H. J., et al. The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96, 857-881 (1988).
- Godino, M. E. C., et al. Amelioration of ischemic brain damage by peritoneal dialysis. J Clin Invest. 123, 4359-4363 (2013).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1310-1316 (2012).
- García-Yébenes, I., et al. Iron overload, measured as serum ferritin, increases brain damage induced by focal ischemia and early reperfusion. Neurochem Int. 61, 1364-1369 (2012).
- Sobrado, M., et al. Synthesis of lipoxin A4 by 5-lipoxygenase mediates PPARgamma-dependent, neuroprotective effects of rosiglitazone in experimental stroke. J Neurosci. 29, 3875-3884 (2009).
- Cuartero, M. I., et al. N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARγ Agonist Rosiglitazone. Stroke. 44, 3498-3508 (2013).
- Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. Journal of Immunological Methods. 194, 71-75 (1996).
- Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).
- Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression. International Journal of Developmental Neuroscience : the Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 21, 431-443 (2003).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
