Ekspression af fluorescerende proteiner i<em> Branchiostoma lanceolatum</em> Af mRNA Injektion i befrugtede oocytter
Summary
Vi rapporterer her den robuste og effektiv ekspression af fluorescerende proteiner efter mRNA injektion i ubefrugtede oocytter fra Branchiostoma lanceolatum. Udviklingen af mikroinjektion teknik i denne basale chordate vil bane vejen for vidtgående tekniske innovationer i denne nye model, herunder in vivo imaging og gen-specifikke manipulationer.
Abstract
We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.
Introduction
Under udvikling, en enkelt celle giver anledning til en hel organisme i en meget kompleks proces, der involverer både celledelinger og bevægelser. For bedre at forstå de biologiske principper dynamikken i celle adfærd, har udviklingsmæssige biologer begyndt at bruge fluorescens-baserede in vivo imaging teknikker. Specifikke rum i celler, såsom cellemembraner, kan enten mærkes ved behandlinger med fluorescerende farvestoffer, en fremgangsmåde hæmmes af en mangel på specificitet og vævspenetration 1, eller af den specifikke indførelse i embryo af exogene mRNA'er koder fluorescerende proteiner 2. Forskellige teknikker kan anvendes til effektiv levering af exogene forbindelser, såsom mRNA'er. Disse indbefatter, men er ikke begrænset til, mikroinjektion, elektroporation, bombardement med mikropartikler, lipofektion og transduktion 3,4. Selv om alle disse fremgangsmåder kan anvendes til at indføre eksogene forbindelser i enudviklende embryo, kun mikroinjektion tillader anvendelse af foruddefinerede og nøjagtige mængder i hver celle 3. Mikroinjektionsteknikker er blevet beskrevet for alle større udviklingsmæssige modelsystemer 4 (fx bananfluer, nematoder orme, zebrafisk, frøer, mus) samt for nogle alternative modeller 4, herunder dem, der anvendes til komparative undersøgelser med henblik på at forstå udviklingen i udviklingsmæssige mekanismer (fx søanemoner, Ledorme orme, søpindsvin, søpung sækdyr, den cephalochordate amphioxus).
Cephalochordates, som sammen med sækdyr og hvirveldyr etablere chordate phylum, er særligt velegnede modeller til at studere udviklingen af chordater og diversificering af hvirveldyr fra en hvirvelløse forfader 5-8. Den cephalochordate slægt afveg meget tidligt under chordate evolution; og bevarede cephalochordates, som er opdelt i tre slægter (Branchiostoma, Asymmetron og Epigonichthys), ligner hvirveldyr både med hensyn til den samlede anatomi og genom arkitektur 5-8. Af de omkring 30 arter af cephalochordates der er blevet beskrevet indtil nu, fem er til rådighed for embryologiske og udviklingsmæssige undersøgelser 6,9: Asymmetron lucayanum (Bahamas lancelet), Branchiostoma floridae (Florida amphioxus), Branchiostoma lanceolatum (den europæiske amphioxus) Branchiostoma belcheri (kinesisk amphioxus) og Branchiostoma japonicum (japansk amphioxus). Modne voksne tre af disse arter (B. lanceolatum, B. belcheri og B. japonicum) kan induceres til at gyde on-demand i ynglesæsonen 10,11. Desuden, i det mindste for B. lanceolatum kan effektiv gydning også induceres i kunstig havvand 12 og derved gøre denne særlige cephalochordate art tilgængelige for LABORATORerne, der ikke har adgang til naturligt havvand. Kombinationen, i B. lanceolatum, af en praktisk og pålidelig adgang til fostre med en effektiv levering metode, såsom mikroinjektion, indtil videre den eneste levering teknik udviklet i amphioxus (i både B. floridae og B. belcheri) 13-15, vil gøre det muligt at udvikle en roman suite af manipulerende teknikker, herunder afstamning tracing- og dynamisk celleopførsel tilgange.
En protokol for effektiv mikroinjektion af mRNA'er til at udtrykke fluorescerende proteiner i B. lanceolatum embryo blev derfor udviklet. Desuden at give en grundlæggende værktøjskasse til levende billeddannelse af B. lanceolatum embryoner blev vektorsystemer udviklet, der tillader membran-associeret og nuklear ekspression af fluorescerende proteiner. For målretning membran blev forstærket grønt fluorescerende protein (eGFP) fusioneret til den humane HRAS CAAX kasse og kernelokalisering af mCherry og eGFP varopnået ved fusion til zebrafisk histon 2B (H2B) exon (figur 1, Supplerende fil 1). Desuden, med det mål at optimere protein translation, Kozak-sekvenser og kodoner af konstruktionerne er blevet modificeret og tilpasset til brug i B. lanceolatum. Tilsammen vil de injektion metode og ekspressionsvektorer præsenteret her tjene som grundlag for generering af nye eksperimentelle tilgange til cephalochordates, bl.a. analyser ved hjælp af den nyeste fluorescens-baserede in vivo imaging teknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikel præsenterer vi for første gang, en detaljeret og reproducerbar protokol til injektion af B. lanceolatum oocytter, som efter B. floridae 13,14 og B. belcheri 15, er således den tredje amphioxus arter, for hvilke der er beskrevet en sådan teknik. Vigtigere er det, protokollen beskrevet her, omfatter også beskrivelsen af vektorsystemer egnede til fremstilling af fluorescerende proteiner i B. lanceolatum fra injicerede mRNA fremstillet in vit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende den støtte fra "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" for dyrehold. Dette arbejde blev støttet af midler fra ANR (ANR-09-Blan-0262-02 og ANR-11-JSV2-002-01) til Michael Schubert, som Den Europæiske Union FP6 tilskud "Embryomics" og af ANR tilskud "ANR- 10-Blan-121801 Dev-processen "til Jean-François Nicolas og Nadine Peyriéras. João Emanuel Carvalho er finansieret af en FCT ph.d. stipendium (SFRH / BD / 86878/2012).
Anmodning om vektorerne er beskrevet her, kan rettes direkte til forfatterne.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1L) | Fisher | W21719 | 0.22 micron filtration |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 micron filtration tube |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | SIGMA | A9414 | |
| Phenol Red | SIGMA | 114537 | |
| Glycerol | SIGMA | G2025 | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | SIGMA | P9155 | |
| H2O Dnase, Rnase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH8 | SIGMA | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | SIGMA | C0549 | |
| 5:1 phenol pH4.7:chloroform | SIGMA | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200x magnification | Leica | MZ16F | 25x oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | heating-filament needle puller |
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
References
- Weber, T., Köster, R. Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae. Methods. 62, 279-291 (2013).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).
- Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. J. Vis. Exp. , e50841 (2014).
- Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems. Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).
- Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
- Holland, L. Z. Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus. Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).
- Lemaire, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates. Development. 138, 2143-2152 (2011).
- Yu, J. K., Holland, L. Z. Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Fuentes, M., et al. Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum). J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).
- Li, G., Shu, Z., Wang, Y. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One. 8, e75461 (2013).
- Theodosiou, M., et al. Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility. J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).
- Holland, L. Z., Yu, J. K. Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods. Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).
- Holland, L. Z., Onai, T. Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).
- Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).
- Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry. 43, 273-278 (2001).
- Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes. Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).
- Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 28, 292 (2000).
- Deheyn, D. D., et al. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).
- Schubert, M., et al. Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development. 132, 61-73 (2005).
- Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus. Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).
- Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos. Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).
- Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer. Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).
- Holland, L. Z., et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology. Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).
- Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster. Gene. 425, 64-68 (2008).
- Li, G., et al. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method. J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).
- Zhang, Q. J., et al. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).
- Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years. J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).
- Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory. PLoS One. 8, e71599 (1371).
